微生物共培養降解β-氯氰菊酯的適宜條件

蘇宏南，陳切希，趙甲元，遲原龍，賈冬英，姚開*

1(四川大學 輕紡與食品學院，四川 成都，610065) 2(旌陽區食品藥品監督管理局，四川 德陽，618000) 3(四川師范大學 生命科學學院，四川 成都，610101)

β-氯氰菊酯(β-cypermethrin，β-CY)是一種高效擬除蟲菊酯類農藥，被廣泛應用于果蔬、谷物等蟲害的防治。β-氯氰菊酯疏水性強、對光熱穩定，自然條件下降解緩慢，在中性土壤中的半衰期可達165 d[1]，長期施用易造成土壤和農產品中殘留量超標，進而對生物體造成危害[2]。微生物降解法因其高效、安全等特點，已成為降解農藥的首選方法之一[3]。

通常，土壤環境中的混合菌株比單一菌株具有更強的農藥降解能力[4]，尤其是具有菌絲體結構的菌株，不僅自身對污染物會有一定的降解作用[5]，還能使其他微生物借助其菌絲體穿越土壤的空隙層，實現更大范圍的分散，增大微生物與土壤中污染物的接觸概率，提高污染物的降解率。此外，菌絲體還能刺激其他微生物的生長和生物活性的表達，從而更有利于微生物作用于土壤中的污染物[6]。

本文以長期噴施擬除蟲菊酯類農藥的菜園土壤為菌源，篩選得到對β-氯氰菊酯具有降解能力的放線菌，并將其與前期篩選得到的對β-氯氰菊酯具有較強降解能力的地衣芽孢桿菌B-1共同培養，考察其對β-氯氰菊酯的適宜降解條件和降解效果，為農產品和糧食中殘留的擬除蟲菊酯類農藥生物降解的深入研究提供參考數據。

1 材料與方法

1.1 試劑與培養基

(1) 試劑：β-氯氰菊酯標準品(純度為99.7%，國家標準物質中心)，色譜純乙腈(美國TEDIA試劑公司)，其他試劑均為國產分析純。

(2) 查氏培養基(CDM)：蔗糖30 g，NaNO31.0 g，KCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，K2HPO4·3H2O 1.0 g，Fe2(SO4)30.01 g，胰蛋白胨0.5 g，吐溫80 2.0 mL，去離子水1 000 mL，pH 7.2～7.4，121℃滅菌20 min。

(3) 高氏一號培養基(GSM)：可溶性淀粉20 g，KNO31.0 g，K2HPO4·3H2O 0.5 g，NaCl 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，吐溫80 2.0 mL，去離子水1 000 mL，pH 7.2～7.4，121℃滅菌20 min。

(4) LB培養基：胰蛋白胨5.0 g，酵母膏2.0 g，NaCl 10 g，吐溫80 2.0 mL，去離子水1 000 mL，pH 7.0，121℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

LC-10AT高效液相色譜儀，日本島津公司；TU-1800PC紫外分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；KQ5200DB數控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；GL-20G-C高速冷凍離心機，上海安亭飛鴿有限公司。

1.3 菌株篩選和鑒定

(1) 菌株B-1：本實驗室前期從茶園土壤中篩選和馴化得到的地衣芽孢桿菌B-1(BacilluslicheniformisB-1)，其在一定條件下對β-氯氰菊酯的降解率為77.0%。

(2) 菌株K-1：從長期噴灑擬除蟲菊酯類農藥的菜園土壤中篩選得到的放線菌。

取土樣1.5 g，置于裝有28.5 mL CDM培養基(β-氯氰菊酯含量為50 μg/mL)的250 mL錐形瓶中，35℃振蕩(150 r/min)培養72 h；然后按5.0%轉接量，依此條件再進行3次重復培養，并依次提高培養基中β-氯氰菊酯含量，分別為100、200、300 μg/mL；將最后一級培養液稀釋后涂布于GSM瓊脂培養基上，35℃培養72 h，對菌落進行分離和純化，從中篩選出對β-氯氰菊酯具有較強耐受性和較好降解能力的理想放線菌。

參照陳少華等的方法對篩選的理想菌株進行生理生化鑒定[8]。菌株16S rDNA測序由上海生工生物工程技術服務有限公司完成，從GenBank數據庫中選擇同源性高的16S rDNA基因序列，利用軟件ClustalX2.3和MEGA6.0構建菌株系統發育樹。

1.4 β-氯氰菊酯含量的測定

用乙腈配制一系列不同含量的β-氯氰菊酯的標準溶液，參照劉芳芳的方法[7]，測定β-氯氰菊酯的HPLC峰面積，平行重復3次，取其平均值。對β-氯氰菊酯含量(X)與其峰面積(Y)進行線性擬合，得到標準曲線方程：Y=68 023X+26 227，R2=0.999 9。

將降解體系勻漿，取5.0 mL降解液與等體積乙腈混合，超聲(80 Hz，160 W)30 min，離心(8 000 r/min)20 min，上清液過有機濾膜(0.45 μm)，濾液進行HPLC檢測，根據標準曲線方程計算β-氯氰菊酯含量，并按公式(1)計算降解率。

降解率/%=(1-D/Dk)×100

(1)

式中:D,降解液中β-氯氰菊酯含量;Dk,空白對照組中β-氯氰菊酯含量。

1.5 菌懸液的制備

(1) 菌株B-1菌懸液:將活化的菌株B-1接種于LB培養基中(β-氯氰菊酯含量為50 μg/mL)，35 ℃振蕩(150 r/min)培養48 h，冷凍離心(4 ℃，8 000 r/min)10 min，沉淀用無菌生理鹽水復溶，調整細胞濃度，制成OD600值為0.8的菌株B-1菌懸液。

(2) 菌株K-1孢子懸液：將活化的菌株接種于GSM瓊脂培養基上(β-氯氰菊酯質量濃度為100 μg/mL)，30 ℃培養72 h。用無菌生理鹽水洗下孢子，振蕩混勻，調整其濃度，制成OD600值為1.0的菌株K-1孢子懸液。

1.6 菌株共培養降解β-氯氰菊酯適宜條件的選擇

(1) 培養基組成：將GSM培養基與LB培養基分別按1∶0、1∶1、0∶1(v/v)的比例混合，分別取β-氯氰菊酯含量為50 μg/mL的混合培養基28.5 mL，分裝于250 mL錐形瓶中。以1∶1(K-1∶B-1，v/v)的接種比例，分別接入菌懸液或孢子懸液，總接種量為5.0%(v/v)，以等量的無菌生理鹽水替代菌懸液及孢子懸液作為空白對照，35℃振蕩(150 r/min)培養72 h，檢測β-氯氰菊酯的含量，并計算其降解率。

(2) 接種比例:取β-氯氰菊酯質量濃度為50 μg/mL的混合培養基28.5 mL，分裝于250 mL錐形瓶中。按5.0%(v/v)的接種量，分別以3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶0、0∶1(K-1∶B-1，v/v)的比例接入其菌懸液或孢子懸液，以等量的無菌生理鹽水替代菌懸液及孢子懸液作為空白對照，35 ℃振蕩(150 r/min)培養72 h，檢測β-氯氰菊酯的含量，并計算其降解率。

(3) 接種方式：取β-氯氰菊酯質量濃度為50 μg/mL的混合培養基28.5 mL，分裝于250 mL錐形瓶中。分別按以下3種方式接入適宜比例的菌懸液或孢子懸液，總接種量為5.0%(v/v)，以等量的無菌生理鹽水替代菌懸液及孢子懸液作為空白對照，35 ℃振蕩(150 r/min)培養72 h，檢測β-氯氰菊酯的含量，并計算其降解率:

①先接種菌株K-1，培養24 h后接種菌株B-1；

②先接種菌株B-1，培養24 h后接種菌株K-1；

③同時接種菌株K-1和菌株B-1。

1.7 菌株共培養降解β-氯氰菊酯的動力學分析

分別取β-氯氰菊酯質量濃度為50、100、200 μg/mL的混合培養基28.5 mL，分裝于250 mL錐形瓶中，按5.0%(v/v)的接種量和2∶1的比例(K-1∶B-1，v/v)接入菌懸液或孢子懸液，35 ℃振蕩(150 r/min)培養5 d，定時取樣，檢測β-氯氰菊酯的含量。選用Logistic方程[9]并利用軟件Origin 8.0對不同β-氯氰菊酯含量隨培養時間的變化進行非線性擬合。

2 結果與討論

2.1 菌株K-1的鑒定

菌株K-1的生理生化特征如表1所示，其16S rDNA基因的PCR擴增結果如圖1所示?？梢钥闯?，菌株K-1符合鏈霉菌特征[8]，其16S rDNA擴增產物凝膠電泳的顯示結果與測序長度1 273 bp吻合。BLAST基因同源性分析結果表明，菌株K-1與Streptomycesneopeptiniusstrain T41(GenBank登錄號為KU317914.1)及Streptomyceschartreusisstrain S14(GenBank登錄號為KT958872.1)均有99%的同源性，據此建立的系統進化樹如圖2所示。綜合菌株K-1的生理生化特征及序列比對結果，最終鑒定其為一株鏈霉菌(Streptomycessp. K-1)。

表1 菌株K-1的生理生化特征Table 1 Physiological and biochemical characteristics ofstrain K-1

注：“+”表示為陽性；“-”表示為陰性。

M-Maker; 1-菌株K-1的PCR產物圖1 菌株K-1 16S rDNA的PCR擴增產物電泳圖Fig.1 Electrophoretogram of 16S rDNA PCR product of strain K-1

*參考菌株來源于GenBank數據庫，括號內為菌株在數據庫中的登錄號圖2 菌株K-1的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain K-1

2.2 菌株共培養降解β-氯氰菊酯的培養基組成確定

不同培養基組成對β-氯氰菊酯降解效果的影響如圖3所示?？梢缘贸?，當培養基為GSM(GSM∶LB=1∶0)和LB(GSM∶LB=0∶1)時，β-氯氰菊酯降解率分別為18.3%和75.3%，而當混合培養基的比例為1∶1(GSM∶LB,v/v)時，β-氯氰菊酯降解率可達80.6%，其原因可能是由于單一培養基中缺乏兩菌株共同生長的營養物質[10]。因此，GSM和LB比例為1∶1(v/v)的混合培養基是菌株B-1和菌株K-1共同培養的適宜培養基。

圖3 培養基組成對菌株共培養降解β-氯氰菊酯的影響Fig.3 Effect of culture compositions on β-CY degradation by co-culture of the strains

2.3 菌株共培養降解β-氯氰菊酯的接種比例確定

兩菌株接種比例對β-氯氰菊酯降解效果的影響如圖4所示?？梢缘贸?，當菌株K-1和菌株B-1的接種比例為2∶1(v/v)時，β-氯氰菊酯的降解率可達84.1%，為適宜的接種比例。菌株生存有其適應的適度空間，兩菌株混合培養時為奪取生存空間及營養物質等資源而相互抑制[4]，且同時接種也會導致兩菌株生長的競爭作用加劇[9]，一定程度上影響了β-氯氰菊酯的降解。

圖4 接種比例對菌株共培養降解β-氯氰菊酯的影響Fig.4 Effect of inoculation ratios on β-CY degradation by co-culture of the strains

2.4 菌株共培養降解β-氯氰菊酯的接種方式確定

菌株接種方式對β-氯氰菊酯降解率的影響如圖5所示?？梢缘贸?，3種不同接種方式的β-氯氰菊酯降解率分別為88.3%、72.55%和83.91%，其中接種方式1的降解效果最佳。一般認為，微生物降解目標底物的過程主要發生在菌體細胞內或胞外酶液環境，但無論哪種過程的目標底物都需與菌體細胞或降解酶發生直接接觸，即生物吸附作用[11]，且生物吸附先行于生物降解。因此，共培養體系中先接種菌株K-1有利于其生長繁殖和菌絲吸附β-氯氰菊酯，并借助生物膜運輸將β-氯氰菊酯傳送給隨后接入的菌株B-1，使后者更大程度地接觸β-氯氰菊酯，并將其降解[12]。

圖5 接種方式對菌株共培養降解β-氯氰菊酯的影響Fig.5 Effect of inoculation methods on β-CY degradation by co-culture of the strains

2.5 菌株共培養降解β-氯氰菊酯的動力學特征

對適宜條件下菌株共培養降解不同含量β-氯氰菊酯的過程進行動力學分析，依據得到的動力學方程計算β-氯氰菊酯的降解速率常數(k)、半衰期(T1/2)和最大比生長速率(Vmax)，結果見圖6和表2?？梢钥闯?，0～1 d時，β-氯氰菊酯含量緩慢下降，降解速率較低，這是因為接種初期的菌株K-1尚處在生長適應期的緣故；1～4 d時，β-氯氰菊酯降解速率明顯增大，這可能是由于菌株K-1的生長形成的菌絲體使加入的菌株B-1更好地接觸并降解β-氯氰菊酯；培養5 d時，不同含量(50、100、200 μg/mL)β-氯氰菊酯的降解率依次為94.0%、85.7%和65.1%。動力學方程的相關系數(R2)均大于0.95，表明其可較好地反映菌株共培養過程中β-氯氰菊酯含量與培養時間的關系。

圖6 菌株共培養降解β-氯氰菊酯的動力學曲線Fig.6 Kinetic curves of β-CY degradation by co-culture of the strains

β-氯氰菊酯/(μg·mL-1)動力學方程R2k/d-1T1/2/dVmax/[μg·(mL·d)-1]50Ct=59.04-59.04[0.94/(1+257.63e-2.6252t)]0.996 32.632.400.62100Ct=102.96-102.96[0.90/(1+65.43e-1.5323t)]0.998 51.533.450.34200Ct=210-210[0.60/(1+75.25e-1.7584t)]0.999 01.7612.290.26

3 結論

從長期噴施擬除蟲菊酯類農藥的菜園土壤中篩選得到1株對β-氯氰菊酯具有較強降解能力的放線菌，根據生理生化特征及16S rDNA測序結果鑒定其為鏈霉菌(Streptomycessp. K-1)。適宜條件下，鏈霉菌K-1與地衣芽孢桿菌B-1共培養對β-氯氰菊酯的降解率較之單獨使用地衣芽孢桿菌B-1提高了11.3%，表明2菌株共培養更有利于β-氯氰菊酯的降解。研究結果可為擬除蟲菊酯類農藥污染農作物土壤的修復和減少農產品中農藥殘留途徑提供參考依據。