維生素C對亞硝酸鹽脅迫下匙吻鱘仔魚非特異性免疫及抗氧化能力的影響

秦國兵，熊 偉，姚俊杰，楊通枝，賈美香

(貴州大學 動物科學學院/高原山地動物遺傳育種與繁殖省部共建教育部重點實驗室，貴州 貴陽 550025)

匙吻鱘(Polyodonspathula)俗稱鴨嘴鱘，是一種古老的大型淡水經濟魚類。在魚苗培育過程中，常常面臨水體環境突變脅迫問題，導致培育期間仔魚死亡率增大。匙吻鱘仔魚孵化出膜后，1～5 d內營養全部依靠卵黃，這個時期是內源營養期。仔魚在第6天左右才開始攝食，開口攝食初期，體內卵黃囊仍未完全消失，營養來自卵黃和外源食物，這個時期是混合營養期?；旌蠣I養期是仔魚從內源的卵黃營養向外源的餌料營養轉變的過渡時期，是魚類早期發育的關鍵時期，在此期未能成功轉食的仔魚即會大量死亡。

維生素C(Vc)是一種水溶性抗氧化劑，可清除氧自由基(Reactive oxygen species，ROS)，保護細胞免受氧化損傷，是動物生長和維持正常生理機能所必需的營養物質，同時在促進魚類生長、提高抗病能力、緩解應激脅迫和創傷愈合方面有明顯作用[1]。相關研究表明，維生素C能提高仔魚免疫和總抗氧化能力(T-AOC)，并降低丙二醛(MDA)含量[2-3]。亞硝酸鹽脅迫下，飼料中添加維生素C對異育銀鯽的堿性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)、溶菌酶(LZM)活性及T-AOC有改善作用[4-5]。同時，維生素C可增強水產動物抗低溫[6]、酸[7]、鹽度[8]、氨氮[9-10]、有機磷農藥[11]和重金屬[12]等脅迫能力，都與其能夠提高機體T-AOC有著密切關系。目前，亞硝酸鹽的急性毒性作用在很多種魚上已被研究[13-16]，但關于亞硝酸鹽脅迫下，水體中添加不同質量濃度維生素C是否能在一定程度上緩解其對匙吻鱘仔魚的脅迫作用未見報道。本研究旨在揭示匙吻鱘仔魚在亞硝酸鹽脅迫下，不同質量濃度維生素C對其脅迫的緩解作用，以期為匙吻鱘魚苗早期培育提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗匙吻鱘來自貴州羅甸縣匙吻鱘養殖基地，平均體質量為(0.051 4±0.001 0)g，平均體長(11.907±0.552)mm。在塑料箱(60 cm×43 cm×35 cm)中進行試驗，置于水深30 cm處。內源營養期的匙吻鱘仔魚為出膜1～5日齡仔魚，混合營養期為6～11日齡仔魚。試驗期間，平均水溫18.5 ℃，pH值6～7，溶氧量>5 mg/L。亞硝酸鹽測試盒購自上海澤芮化學科技有限公司，酶活性測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.2 試驗設計與方法

參考譚樹華等[13]研究，設置亞硝酸鹽質量濃度為0.5 mg/L。本研究設置6個試驗組，每組3個平行，1 000尾/箱。對照組中不添加亞硝酸鹽及維生素C；處理組試驗用水均含質量濃度為0.5 mg/L亞硝酸鹽，除脅迫組外，在其余4個處理組中又分別添加30、60、90、120 mg/L 維生素C。每隔1 h用亞硝酸鹽測試盒檢測亞硝酸鹽質量濃度，低于0.5 mg/L時，加入先配好的亞硝酸鹽，保證其質量濃度不變，期間換亞硝酸鹽及維生素C溶液溫差不超過1 ℃。取樣時間是亞硝酸鹽脅迫后12、24、48、72 h，本研究的12 h和24 h取樣時間為仔魚內源營養期，48 h和72 h為混合營養期，取仔魚整體保存在-20 ℃，用于LZM、ACP、AKP活性，T-AOC，MDA含量的測定。

1.3 數據處理

數據用SPSS 19.0軟件處理，進行方差分析(One-way ANOVA)和多重比較，結果以平均值±標準誤表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 維生素C對亞硝酸鹽脅迫下匙吻鱘仔魚不同發育階段LZM活性的影響

亞硝酸鹽脅迫下維生素C對仔魚LZM活性影響見圖1。在同一取樣時間下，12 h和24 h的LZM隨維生素C質量濃度的增加，呈現升高趨勢，且90 mg/L和120 mg/L維生素C添加組顯著高于脅迫組(P<0.05)，在48 h和72 h，LZM活性呈現“升高—降低”趨勢，且90 mg/L 維生素C添加組LZM活性均顯著高于脅迫組(P<0.05)。90 mg/L 維生素C添加組的LZM活性從24 h至48 h顯著上升(P<0.05)，上升率為71.8%。

不同小寫字母表示相同時間不同試驗組間差異顯著(P<0.05)， 不同大寫字母表示相同試驗組從內源營養期到混合營養期 顯著上升(P<0.05)，下同圖1 維生素C對亞硝酸鹽脅迫下匙吻鱘仔魚LZM活性的影響

2.2 維生素C對亞硝酸鹽脅迫下匙吻鱘仔魚不同發育階段AKP活性的影響

亞硝酸鹽脅迫下維生素C對仔魚AKP活性影響見圖2。在相同取樣時間下，12 h和24 h的AKP活性隨維生素C質量濃度的增加呈現升高趨勢，且除24 h時90 mg/L維生素C添加組與對照組差異不明顯外；其他90 mg/L和120 mg/L維生素C添加組均顯著高于對照組和脅迫組(P<0.05)。在48 h和72 h，AKP活性呈現“升高—降低”趨勢，且90 mg/L維生素C添加組顯著高于脅迫組(P<0.05)。90 mg/L維生素C添加組的AKP活性從24 h至48 h顯著上升(P<0.05)，上升率為33.7%。

圖2 維生素C對亞硝酸鹽脅迫下匙吻鱘仔魚AKP活性的影響

2.3 維生素C對亞硝酸鹽脅迫下匙吻鱘仔魚不同發育階段ACP活性的影響

亞硝酸鹽脅迫下維生素C對仔魚ACP活性影響見圖3。在相同取樣時間下，12 h和24 h的ACP活性隨維生素C質量濃度的增加呈現逐漸升高趨勢，且90 mg/L和120 mg/L維生素C添加組顯著高于對照組和脅迫組(P<0.05)。在48 h和72 h，ACP活性呈現“升高—降低”趨勢，且90 mg/L維生素C添加組顯著高于對照組和脅迫組(P<0.05)。90 mg/L維生素C添加組的ACP活性從24 h至48 h顯著上升(P<0.05)，上升率為48.4%。

圖3 維生素C對亞硝酸鹽脅迫下匙吻鱘仔魚ACP活性的影響

2.4 維生素C對亞硝酸鹽脅迫下匙吻鱘仔魚不同發育階段T-AOC的影響

亞硝酸鹽脅迫下維生素C對仔魚T-AOC影響見圖4。在同一取樣時間下，T-AOC隨維生素C質量濃度的增加，均呈現升高趨勢。與對照組相比，脅迫組的T-AOC在12 h和24 h無顯著差異(P>0.05)，在48 h和72 h顯著降低(P<0.05)。90 mg/L和120 mg/L維生素C添加組的T-AOC從24 h至48 h顯著上升(P<0.05)，上升率分別為61.1%和43.9%。

2.5 維生素C對亞硝酸鹽脅迫下匙吻鱘仔魚不同發育階段MDA含量的影響

亞硝酸鹽脅迫下維生素C對匙吻鱘仔魚MDA含量影響見圖5。脅迫組的MDA含量均顯著高于維生素C添加組和對照組(P<0.05)，且不論是內源營養期還是外源營養期，相同取樣時間下，隨著維生素C質量濃度的升高，MDA含量均呈下降趨勢。如圖5可知，120 mg/L 維生素C添加組的MDA含量最低，比脅迫組和對照組顯著下降(P<0.05)，12～72 h下降率分別為40.3%、62.2%、69.9%、37.4%與26.3%、17.6%、18.0%、6.3%，維生素C添加組MDA含量從24 h至48 h無顯著變化(P>0.05)。

圖5 維生素C對亞硝酸鹽脅迫下匙吻鱘仔魚MDA含量的影響

3 結論與討論

3.1 維生素C對亞硝酸鹽脅迫下匙吻鱘仔魚內源營養期及混合營養期LZM、AKP、ACP活性影響

魚類早期發育生長中，由于其免疫器官還未分化發育成熟，此階段抵抗外界病原微生物主要依賴于非特異性免疫和母源性免疫[17]，在非特異免疫應答中LZM、AKP、ACP發揮著重要作用[18-19]，其活性能夠反映仔魚的免疫力，非特異性免疫能力低是引起仔魚死亡的原因之一。匙吻鱘仔魚在自然生長條件下，內源營養期到混合營養期，AKP、ACP活性顯著增加，可能是此階段仔魚腸道發育逐漸完善，腸道細胞需要更多的磷酸酶對大分子物質進行吸收。LZM作為非特異性防御機制的第一道防線，其主要功能是消化和防御，不同物種中LZM的功能不同，這是由其基因結構決定的。當仔魚受到外界刺激時，機體內的LZM在不同組織的表達量出現一定的變化，來應對這些脅迫作用。匙吻鱘仔魚從內源營養期到混合營養期LZM活性顯著升高，說明仔魚在開口攝食后，外源餌料生物會刺激LZM相關基因的表達，進而提高其活性。

匙吻鱘仔魚隨著日齡的增長，受亞硝酸鹽的脅迫逐漸加深。亞硝酸鹽毒性效應與質量濃度、暴露時間、魚的種類、魚體大小及年齡等密切相關[20]，隨脅迫時間延長，亞硝酸鹽會影響細胞膜的通透性，進而抑制免疫酶的合成和分泌。相關研究表明，亞硝酸鹽脅迫會降低磷酸酶和LZM活性[21]，同時升高魚體內ROS水平，進而對機體免疫力產生一定的抑制作用。維生素C作為一種重要的免疫增強劑，能進入卵黃囊仔魚體內，可以提高吞噬細胞的吞噬活性和殺傷力，促進淋巴細胞的增殖和特異性抗體的產生。本研究匙吻鱘仔魚內源營養期，受亞硝酸鹽脅迫下，隨維生素C質量濃度的增加，仔魚LZM、AKP、ACP活性增加，說明維生素C能夠提高匙吻鱘仔魚非特異性免疫功能，在相關研究結果中也得到了證實[4]。在混合營養期，LZM、AKP、ACP活性顯著升高，表明仔魚開口攝食后，其各項生理機能開始不斷完善，此時既可以從卵黃吸收營養又可以從餌料中獲得，使免疫防御不斷加強；另一方面，說明維生素C進入匙吻鱘仔魚體內，不僅有解毒功能，同時可消除亞硝酸鹽脅迫帶來的ROS，進而提高仔魚機體非特異性免疫防御。

3.2 維生素C對亞硝酸鹽脅迫下匙吻鱘仔魚內源營養期及混合營養期T-AOC的影響

在匙吻鱘仔魚自然生長中，隨日齡的增長，T-AOC逐漸增加。其中在內源營養期，上升不明顯，而到了混合營養期顯著升高。少量ROS是生物體所必需的，但過多的ROS如果不能被及時清除，它們將會攻擊各種生物大分子，引起生物體各種生理病變。在匙吻鱘仔魚不斷發育過程中，其各項生理機能不斷完善，在開口攝食后，機體代謝加強，使得耗氧率不斷增加，產生的ROS越來越多，為保證機體內ROS的動態平衡，機體必須清除過多的ROS。此時，抗氧化酶系統發揮重要作用。本研究中隨仔魚的發育，T-AOC不斷升高，說明仔魚體內的抗氧化防御系統逐步發育完善，在相關研究中已得到證實[21]。

匙吻鱘仔魚隨日齡的增長，T-AOC受亞硝酸鹽脅迫的影響逐漸降低。內源營養期，T-AOC受影響較大；混合營養期受影響較小。亞硝酸鹽脅迫使仔魚血液中亞鐵蛋白氧化成高鐵紅蛋白，并通過呼吸作用來改變內臟器官的皮膜通透性，滲透調節失調，進而阻礙細胞分化，導致仔魚畸形或死亡[22]，使免疫機能降低。同時，亞硝酸鹽脅迫會使魚機體非特性免疫及抗氧化能力下降[23]。本研究發現，隨維生素C質量濃度的增加，內源營養期仔魚T-AOC逐漸升高，MDA含量顯著降低，表明亞硝酸鹽脅迫下，水中添加適宜的維生素C可以提高匙吻鱘內源營養期仔魚T-AOC。而在混合營養期，維生素C組T-AOC與脅迫組差異明顯，且隨維生素C質量濃度的增加出現升高現象，表明一方面混合營養期仔魚對低質量濃度的亞硝酸鹽的耐受力逐漸增強；另一方面，可能在此階段仔魚除了從水體中獲得維生素C外，也從攝食的餌料中獲得，使得仔魚體內維生素C含量增加，具體原因有待進一步研究。

3.3 90 mg/L 維生素C對亞硝酸鹽脅迫下匙吻鱘內源營養期及混合營養期仔魚的保護

不同質量濃度維生素C對魚類在抗環境脅迫方面有重要作用[2,24]，維生素C 可以通過發揮抗氧化功能來阻止多不飽和脂肪酸過氧化，避免細胞膜遭受氧化損傷，提高魚體的免疫力和抗病力。不同魚類的卵黃囊期仔魚，用不同質量濃度維生素C浸泡有不同作用效果[25]。

在亞硝酸鹽脅迫下，本研究用不同質量濃度維生素C溶液浸泡內源營養期仔魚，90 mg/L、120 mg/L維生素C組LZM、AKP、ACP活性及T-AOC顯著高于脅迫組和對照組，說明匙吻鱘仔魚在內源營養期，外源添加維生素C質量濃度越高，仔魚機體抗環境脅迫越強。剛出膜仔魚，沒有卵膜的保護，對不良環境敏感性下降，水體中直接添加可溶性維生素C，其小分子結構可以通過魚呼吸器官吸收，能夠進入仔魚體內，維持魚體正常生理機能。而在仔魚混合營養期，120 mg/L 維生素C組雖顯著降低了ROS對機體的氧化損傷，但同時也降低了LZM、AKP、ACP活性，說明高質量濃度維生素C溶液抑制了匙吻鱘混合營養期仔魚的非特異性免疫酶活性，這可能是不同發育時期，不同魚類對維生素C代謝率不同，從而導致維生素C需要量的差異，使維生素C對魚類免疫力作用的形式也不同。綜合考慮實際養殖情況及本研究維生素C添加組對匙吻鱘內源營養期和混合營養期仔魚LZM、AKP和ACP的影響情況，亞硝酸鹽脅迫下，90 mg/L維生素C對匙吻鱘仔魚的保護效果較好。