高能脈沖氙光致眼組織損傷防護方法研究*

龍 盤 嚴偉明 陳 濤 王 喆 張千里 薛軍輝 張作明

(1.空軍軍醫大學航空航天臨床醫學教研室，西安 710032)(2.空軍軍醫大學基礎醫學院，西安 710032)

移動式高能氙光消毒機利用惰性氣體氙氣產生強紫外脈沖，在極短的時間內釋放出極高能量的原理，達到消毒和凈化空氣的效果。該設備由于具有殺菌效率高，時間短，冷滅菌等優勢，目前已被應用于動物房傳遞窗消毒。但是高能脈沖光對動物的視覺系統的安全性還不甚清楚，本實驗主要通過系列視覺相關檢查對其安全性以及防護方法進行評估。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1材料： 移動式高能氙光消毒機(MX-3600)由西安富康空氣凈化設備有限公司生產。高能氙光消毒機外徑尺寸為515 mm×515 mm×880 mm(長×寬×高)，脈沖氙燈(XENEX，美國)10 inch，波長100～400 nm，頻率1～10 Hz。單次脈沖能量為207 J(約為紫外燈的50.000倍)。

1.1.2實驗動物：60只SD大鼠，體質量200～250 g，購自第四軍醫大學動物實驗中心。

1.1.3大鼠固定裝置：塑料瓶20個，剪去底蓋，側壁剪開，塑料膠帶固定。

1.2 實驗分組及處理

隨機將SD大鼠(n=60)分為陽性對照組、手術鋪單組、薄白色塑料板組、薄棕色塑料板組、厚棕色塑料板組和陰性對照組(n=10)。將移動式高能脈沖氙光消毒機設置工作參數頻率1 HZ，時間5 min，大鼠均固定于自制的大鼠固定器，放置高度80 cm，距離消毒機1 m處。重復上述操作，每日2次，連續暴露5 d后，觀察系列指標。

1.3 觀察指標

1.3.1裂隙燈觀察：SD大鼠于高能脈沖氙光照射5 d后，于結膜囊內滴20 μL熒光素鈉(1%)，用2 mL生理鹽水緩慢沖洗。然后將SD大鼠置于裂隙燈鈷藍燈模式下拍攝，拍攝角度35°，調整焦距使得焦點落于角膜平面上。拍攝時按照角膜損傷評分方法進行評分，將角膜分為四個象限，每個象限單獨積分，之后加起來。評分方法如下，0分：角膜無熒光素鈉著染，干凈透明；1分：角膜有點狀熒光素鈉著染，但是著染點小于30個；2分：角膜有點狀熒光素鈉著染大于30個，或者點狀損傷融合成片狀；3分：角膜有大片熒光素鈉著染。

1.3.2全視野閃光視網膜電圖(ffERG)：大鼠于末次高能脈沖光照射后暗適應12 h，于紅光環境下進行視網膜電圖檢測。操作方法簡述如下，大鼠常規腹腔注射麻醉后(3 mL/kg體質量1%戊巴比妥鈉+50 μL 100%速眠新)，托比卡胺散瞳后，將大鼠置于操作臺上固定，正極為角膜銀電極，負極為臉頰針電極，尾巴針電極接地，按照羅蘭電生理操作系統進行操作。操作標準為國際電生理標準的五項檢查。

1.3.3相干光斷層成像掃描(OCT)和眼底彩照檢測：大鼠常規麻醉后，托比卡胺散瞳后，將大鼠放置于特制的鼠臺，采用ISOCT眼科超顯微成像系統(optoprobe, Canada)對大鼠視網膜進行斷層掃描。之后采用OPTO-III視網膜成像系統(optoprobe, Canada)進行眼底彩照的拍攝。

1.3.4病理檢測：小心摘取眼球之后，放置于制備的眼球固定液中，固定24 h后，脫水包埋制備蠟塊，于石蠟切片機切片(4 μm)，烤片脫水之后進行角膜和視網膜HE病理染色，于光學顯微鏡下觀察(DP71, Olympus, Japan)，每張切片觀察3個位置取平均值進行統計。

1.4 統計方法

2 結果

2.1 裂隙燈(鈷藍光)觀察大鼠角膜熒光素鈉著染

熒光素鈉可以使上皮缺損的角膜著色，實驗結果顯示陰性對照組角膜干凈透明，無熒光素鈉著染，陽性對照組角膜有點狀、樹枝狀、片狀熒光素鈉著染；手術鋪單組角膜有點狀、片狀熒光素鈉著染；白色薄塑料板組角膜有點狀、樹枝狀熒光素鈉著染；棕色薄塑料板組和棕色厚塑料板組角膜干凈透明，未見明顯熒光素鈉著染，見圖1A。陽性對照組，手術鋪單組和白色薄塑料板組角膜熒光素鈉染色評分大于陰性對照組(P<0.05)；棕色薄玻璃板組和棕色厚玻璃板組角膜熒光素鈉染色評分和陰性對照組相比無統計學意義(P>0.05)，見圖1B。

圖1 角膜熒光素鈉染色及評分(n=10)注：A，角膜熒光素鈉染色；B，角膜熒光素鈉染色評分；a，陽性對照組；b，手術鋪單組；c，白色薄塑料板組；d，棕色薄塑料板組；e，棕色厚塑料板組；f，陰性對照組；點狀熒光素鈉著染(黑色箭頭)，樹枝狀熒光素鈉著染(黃色箭頭)，片狀熒光素鈉著染(紅色箭頭)；*P<0.05, a, b, c, d, evs fFig.1 Corneal fluorescein sodium staining and grading(n=10)Note:A, Corneal fluorescein sodium staining; B. The score of corneal fluorescein sodium staining; a, positive control group; b. surgical drapes group;c, thin white plastic sheet group; d, thin brown plastic sheet group; e, thick brown plastic sheet group; f, negative control group; The dot fluoresceinsodium (black arrow), the dendritic fluorescein sodium (yellow arrow), the fluorescein sodium dye (red arrow); *P<0.05, a, b, c, d, evs f

2.2 全視野閃光視網膜電圖(ffERG)

感光細胞對于強光損傷是非常敏感的， ffERG用來評估高能脈沖氙光對視網膜尤其是感光細胞的損傷。各組典型ffERG波形圖見圖2。

圖2 各組典型視網膜電圖表現注：A, 暗視3.0反應；B，OPs波；C，明視3.0反應a，陽性對照組；b，手術鋪單組；c，白色薄塑料板組；d棕色薄塑料板組；e棕色厚塑料板組；f，陰性對照組 Fig.2 Typical retinal electrogram of each groupNote：A, dark-adaptation 3.0 response; B, OPs wave; C, light-adaptation 3.0 response. a, positive control group; b. surgical drapes group; c, thin white plastic sheet group; d, thin brown plastic sheet group; e, thick brown plastic sheet group; f, negative control group

2.2.1暗視3.0反應：陽性對照組和手術鋪單組暗視3.0反應的b波振幅顯著小于陰性對照組(P<0.05)，陽性對照組和手術鋪單組暗視3.0反應b波的峰時值延長(P<0.05)；白色薄塑料板組，棕色薄塑料板組和棕色厚塑料板組暗視3.0反應b波幅值和峰時值與陰性對照組相比無統計學差異(P> 0.05)，見圖3。

圖3 暗視3.0反應b波幅值和峰時值(n=10)注：A，陽性對照組；B，手術鋪單組；C，白色薄塑料板組；D，棕色薄塑料板組；E，棕色厚塑料板組；F，陰性對照組*P<0.05, A, B, C, D, Evs F；**P<0.01, A, B, C, D, E vs FFig.3 The amplification b wave (dark-adaptation 3.0 response) and the peak time of b wave (n=10)A, positive control group; B. surgical drapes group; C, thin white plastic sheet group; D, thin brown plastic sheet group; E, thickbrown plastic sheet group; F, negative control group; *P<0.05, A, B, C, D, Evs F；**P<0.01, A, B, C, D, E vs F

2.2.2Ops波：陽性對照組和手術鋪單組∑OPs1-4與陰性對照組相比顯著降低(P<0.05)；白色薄塑料板組、棕色薄塑料板組和棕色厚塑料板組∑OPs1-4與陰性對照組相比差異無統計學差異(P>0.05)，見圖4。

圖4 各組∑OPs1-4幅值(n=10)注：A，陽性對照組；B，手術鋪單組；C，白色薄塑料板組；D棕色薄塑料板組；E棕色厚塑料板組；F，陰性對照組*P<0.05, A, B, C, D, Evs FFig.4 The amplification of ∑OPs1-4 (n=10)Note：A, positive control group; B. surgical drapes group; C, thin whiteplastic sheet group; D, thin brown plastic sheet group; E, thick brownplastic sheet group; F, negative control group;*P<0.05, A, B, C, D, Evs F

2.2.3明視3.0反應:陽性對照組和手術鋪單組與陰性對照組相比明視3.0反應b波振幅降低(P<0.05)，峰時值延長(P<0.05)；白色薄塑料板組，棕色薄塑料板組和棕色厚塑料板組明視3.0反應b波幅值和峰時值與陰性對照組相比無統計學差異(P> 0.05)，見圖5。

2.3 相干光斷層成像(OCT)

陽性對照組和各防護組的視網膜全層厚度與陰性對照組相比無統計學差異(P>0.05)；而陽性對照組和手術鋪單組外核層厚度與陰性對照組相比變薄(P<0.05)，見圖6。

2.4 眼底彩照

眼底彩照結果顯示陽性對照組及各防護組眼底未見明顯異常，見圖7。

圖5 明視3.0反應b波振幅和峰時值(n=10)注：A，陽性對照組；B，手術鋪單組；C，白色薄塑料板組；D棕色薄塑料板組；E棕色厚塑料板組；F，陰性對照組；*P<0.05, A, B, C, D, Evs FFig.5 The amplification b wave (light-adaptation 3.0 response) and the peak time of b wave (n=10)Note：A, positive control group; B. surgical drapes group; C, thin white plastic sheet group; D, thin brown plastic sheet group;E, thick brown plastic sheet group; F, negative control group; *P<0.05, A, B, C, D, Evs F

圖6 視網膜全層和外核層厚度注：a，陽性對照組；b，手術鋪單組；c，白色薄塑料板組；d，棕色薄塑料板組；e，棕色厚塑料板組；f，陰性對照組**P<0.01, a,b, c, d, e vs fFig.6 The thickness of whole retinal and outer nuclear layer (ONL)Note：a, positive control group; b. surgical drapes group; c, thin white plastic sheet group; d, thin brown plastic sheet group;e, thick brown plastic sheet group; f, negative control group; **P<0.01, a,b, c, d, e vs f

圖7 眼底彩照注：A：陽性對照組；B，手術鋪單組；C，白色薄塑料板組；D棕色薄塑料板組；E棕色厚塑料板組；F，陰性對照組Fig.7 Fundus photographNote：A, positive control group; B. surgical drapes group; C, thin white plastic sheet group; D, thin brown plastic sheet group; E, thick brown plastic sheet group; F, negative control group

2.5 病理改變

2.5.1角膜：角膜HE染色顯示陽性對照組可見角膜上皮層粗糙，基底層細胞增生活躍，基質層網狀結構斷裂皺褶，基質交聯纖維變細；各防護組和陰性對照組角膜病理結構未見明顯改變，見圖8。

2.5.2視網膜：視網膜HE染色結果與OCT相一致，陽性對照組和手術鋪單組與陰性對照組相比視網膜外核層細胞層數減少(P<0.05)，見圖9～10。

3 討論

SPF級動物是各種生物學實驗的標準使用動物，而關于SPF級動物飼養設施建設的重要的一個環節就是消毒滅菌[1]。傳遞窗作為外界環境與動物房潔凈室之間的傳遞通道，在防止病原微生物進入潔凈環境起到重要作用。目前常用的傳遞窗消毒設備為紫外燈，由于其消毒時間長以及消毒效率低，給實際應用帶來諸多不便[2]。高能脈沖氙光由于其具有消毒效率高(殺菌率>99%)，消毒時間短(1 min)，冷消毒(不產生熱量)等一系列優點[3-4]，其可能將取代傳統的物理和化學殺菌手段。但是，生物安全性等問題也隨著而來。

高能脈沖氙光瞬間釋放的超高能量，以及高能量電離空氣產生臭氧對動物是否安全？尤其是動物眼部組織成為困擾工作人員的一個問題。本研究發現，高能脈沖氙光最大照射時間5 min/次，2次/d，持續5 d后，會對動物的角膜和視網膜產生一定程度的損傷，相關研究也表明強紫外線可造成視網膜功能的急性損傷，這種損傷往往恢復較快[5]，這種損傷類似于雪盲以及電弧性眼損傷等，往往1～2 d就會恢復[6]。實驗發現末次照射7 d后視網膜功能可以基本恢復正常(數據未給出)，為什么恢復時間晚于一般的強紫外線損傷呢？估計是否由于其產生紫外線的能量太強，白化大鼠缺乏視網膜色素上皮的保護，使得感光細胞由于局部能量過大產生凋亡[7]；亦或者是其產生的臭氧對視網膜的結構和功能造成一定影響，這還有待于進一步探索驗證。

圖10 視網膜外核層細胞層數量(n=5)注：A，陽性對照組；B，手術鋪單組；C，白色薄塑料板組；D棕色薄塑料板組；E棕色厚塑料板組；F，陰性對照組*P<0.05, A, B, C, D, Evs FFig.10 The number of retinal ONL cell layers (n=5)Note：A, positive control group; B. surgical drapes group; C, thin white plastic sheet group; D, thin brown plastic sheet group; E, thick brown plastic sheet group; F, negative control group;*P<0.05, A, B, C, D, Evs F

同時，實驗中我們發現手術鋪單、白色薄塑料板、棕色薄塑料板和棕色厚塑料板對高能脈沖氙光眼部損傷均具有一定的防護作用，其中手術鋪單防護作用較弱。由于紫外線對眼睛的損傷主要與波長，強度，照射時間，光照方式有關[8-9]。高能脈沖氙光主要產生短波長的紫外線，短波長的紫外線由于波長短，能量大，衍射性差，對眼睛的損傷主要是角膜，但是由于其短時間釋放能量巨大，大約為到達地面太陽光強度的100 000倍，部分能量會通過光通路而作用于相應的視網膜區域從而部分損傷視網膜。同樣的，對于高能脈沖氙光的防護也就相對比較容易，主要考慮兩個問題：1. 高能脈沖氙光的穿透力；2. 周圍墻壁的反射。針對于第一個問題，我們發現厚度為3 mm的白色塑料板就足以防護高能脈沖氙光的損傷，且深色的材料的防護效果要優于淺色的材料。針對第二個問題，我們建議全面防護動物的眼組織或者用疏松且容易吸收脈沖光的材料進行墻壁布置。

綜上，高能脈沖氙光作為一種新型的動物房消毒設備，具備一系列消毒優點，但是其對動物的眼睛的安全性具有一定影響，在使用過程中，操作人員需要做好動物防護。