空氣暴露時間對林麝糞便孕酮水平的影響

唐 婕，李晶晶，王 波，索麗娟，王 艷*，嚴興榮*

(1.陜西省動物研究所, 陜西西安 710032;2.西北大學生命科學學院陜西省西部資源與生物技術教育部重點實驗室,陜西西安 710069;3.陜西省野生動物保育重點實驗室，陜西西安 710069)

林麝是我國特有的能產麝香的野生動物。麝香僅雄性林麝產生，其生殖器和肚臍之間有一個產麝香的香囊。麝香是名貴中藥材，是多種傳統中藥方劑的主要原料。為了獲取麝香，林麝遭到肆意捕殺，數量急劇減少，被列為國家一級保護動物。林麝一年發情一次，主要集中在秋冬季節，雌麝這個時期錯過交配機會或空懷，則需等到第二年發情期。因此，早期林麝妊娠診斷可充分利用林麝現有種質資源，減少空懷數量，進行大量繁育。目前，還沒有有效的林麝早期妊娠診斷方法，雖有研究報道，但均處于研究階段。早期妊娠診斷在人類醫學上已經成熟，如利用超聲和試紙條技術，胎兒在4周末出現點狀的囊腔結構，6周可出現胎兒的心跳搏動，所以超聲診斷在人妊娠診斷中準確度較高的時期是第6周[1]。牛的超聲早期妊娠診斷可在28 d～30 d就可用胚囊環和胎兒心跳進行確診，也可通過直腸觸摸的方式鑒定是否妊娠[2]。羊的妊娠診斷很少用超聲診斷方法[3]。一般的羊場數量較多，用超聲的方法操作難度大，通過試情的方法，觀察動物返情情況，根據返情行為推測其是否妊娠[4]。野生動物早期妊娠診斷的研究報道較少，圈養野生動物有用超聲診斷的報道，但報道較少[5]。除了超聲診斷，通過妊娠相關激素檢測進行妊娠診斷的方法報道較多，人妊娠試紙條是檢測尿液的人絨毛膜促性腺激素( human chorionic gonadotropin,hCG)含量，觀察妊娠情況，但由于物種差異，人的妊娠試紙條很難應用到其他動物。孕酮是妊娠早期由黃體分泌的甾體激素，主要涉及動物妊娠的維持。人妊娠診斷用孕酮和hCG來預測妊娠狀態。有研究用豬糞便中孕酮含量來診斷其妊娠狀態并監測卵巢機能[6]。馬鹿不同季節糞便中孕酮也呈周期性變化，同時也可評估動物健康狀態，或作為早期妊娠檢測的手段[7]。類固醇激素檢測方法相關報道較多，如酶聯免疫吸附劑試驗(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)和高效液相色譜(high performance liquid chromatography, HPLC)。ELISA實用性較廣，已經有對林麝、羊、豬、駱駝和猴等動物類固醇激素檢測的研究報道[3,8-9]。HPLC也常用于類固醇激素的檢測，張立雯等[10]用HPLC檢測大鼠血漿和子宮孕酮濃度，同時可對孕酮及其代謝物進行藥代動力學研究。也有研究發現，HPLC可對孕酮、丙酸睪酮和苯甲酸雌二醇進行精確定量[11]，這些結果對本研究提供了參考。

林麝是新興的圈養動物，很多飼養技術均來自長期的實踐和借鑒其他家養動物的經驗。林麝早期妊娠診斷是圈養林麝技術的關鍵環節。林麝天生孤僻膽小，妊娠早期通過抓捕等手段進行超聲診斷有導致流產的可能。因此，糞便類固醇激素的檢測是目前首選的診斷方法。目前關于林麝糞便類固醇激素的研究報道較多，類固醇激素在體外保存的時效性，發情周期孕酮的變化均有研究報道[12-14]。本研究在前人研究基礎上，利用ELISA和HPLC兩種方法檢測林麝糞便孕酮含量進行比較；野生動物糞便均在野外和山區進行采集，采集時間的新鮮度難以保證，本研究探索不同新鮮度糞便孕酮的水平變化及確定妊娠和非妊娠林麝糞便孕酮水平，為孕酮用于妊娠診斷奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗用動物 圈養林麝，飼養于鳳縣周家莊蔣家溝逢春林麝繁育基地，自由飲食，除飼養員外沒有其他外界因素干擾。

1.1.2 采樣和糞便處理 確定妊娠中期和非妊娠的林麝各3只，每隔1 d采集糞便1次，共采集3次，每次采集后進行激素提取。采集妊娠期的糞便，在空氣暴露不同時間，分別于暴露0、2、4、6 d。在不同時間收集糞便，直接提取孕酮。

1.1.3 主要試劑 糞便DNA提取試劑盒，MP Biomedicals公司產品；PCR mix，近岸蛋白質科技有限公司產品；甲醇、乙腈，美國Fisher公司產品；Agilent TC-18(250 mm×4.6 mm,5 μm)，安捷倫科技公司產品；磷酸，天津市瑞金特化學品有限公司產品；鹿孕酮檢測試劑盒，上海嵐派生物公司產品。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取和PCR 稱取0.3 g新鮮糞便，用糞便DNA提取試劑盒分離糞便總DNA，具體方法按照試劑盒的操作指南進行。以林麝的內參基因GAPDH(forward:3′-TCACCGAGGCTGCTTTTAAT-5′； reverse:3′-GATCTCGCTCCTGAGAGATG-5′)來檢測糞便是否來自于林麝，PCR體系為20 μL，引物0.3 μL，模版0.3 μL，無菌雙蒸水(ddH2O) 9.4 μL，PCR mix 10 μL，混勻，離心備用，每次做3個重復。PCR條件為：94℃ 5 min；94℃ 30 s,59℃ 30 s,72℃ 1 min，共35個循環；72℃ 10 min，4℃ 10 min。PCR產物用15 g/L瓊脂糖凝膠電泳分離目的條帶，在凝膠成像系統中觀察結果。

1.2.2 孕酮提取 稱取0.5 g糞便樣本，按照以前報道的方法提取激素。稱取0.5 g林麝糞便，每個樣本稱取2份，1份用于提取激素，另1份在120℃烘干30 min，稱取烘干后糞便質量。提取激素的糞便，用提取液(甲醇∶水=9∶1)5 mL與研磨后的糞便充分振蕩混勻，在試管中蒸20 min，1 500 r/min離心10 min，取上清，再次加入5 mL提取液振蕩混勻，1 500 r/min離心10 min收集溶液，蒸干加入1 mL甲醇充分溶解，用1.5 mL EP管收集后立即檢測或置-20℃保存備用。

1.2.3 孕酮含量測定

1.2.3.1 HPLC法 HPLC測定孕酮含量方法參照文獻[10]的色譜條件。使用Agela Venusil C8 (4.6 mm ×250 mm,5 μm)色譜柱,乙腈∶水= 60∶40 (水中加1 g/L磷酸), 流速0.8 mL/min, 檢測波長240 nm，柱溫40℃，進樣量10 μL。

標準溶液的配制：混合對照工作液，以甲醇為溶劑配制貯備液,黃體酮濃度為3.2 mg/mL。將貯備液用倍數稀釋法稀釋成含系列濃度的對照工作液，濃度分別為3.2 mg/mL、320 μg/mL、3.2 μg/mL、320 ng/mL。

測定方法：處理好的樣品經0.22 μm的濾膜過濾，吸取預處理所得樣品上清液10 μL,注入色譜儀,記錄測定組分峰面積,代入隨行標準曲線求得樣品中所含測定組分的濃度。

1.2.3.2 ELISA法 用ELISA檢測甲醇中的孕酮含量參照文獻[15]方法。試劑盒用鹿孕酮檢測試劑盒(DM-D10706)，具體方法按照試劑盒操作指南進行，先按照說明書制作標準曲線，同時增加樣品孔，檢測樣本孕酮濃度。

1.2.4 統計分析 每個樣本檢測的結果，用糞便干重進行矯正，即用ELISA檢測結果與糞便干重進行計算干重糞便的孕酮含量,單位為ng/g。試驗獨立重復3次，數據用Spass 13.0軟件處理，用t檢驗進行顯著性檢測，P<0.05為差異顯著。結果用平均值±標準差表示。

2 結果

2.1 糞便空氣暴露顯著降低糞便水分和改變糞便形態

新鮮糞便表面光澤、平滑，隨著空氣中暴露時間延長，糞便表面粗糙程度增加，并失去光澤(圖1)。

由圖2可知，本研究6個糞便樣本均來源于林麝。

4 d 和6 d的糞便濕重和干重的比例率顯著低于0 d(P<0.05)，2 d的水分丟失率與0 d無顯著差異(P>0.05) (圖3)。且以林麝內參基因GAPDH為引物進行PCR顯示有相應條帶(圖2)。結果表明，林麝顆粒狀糞便在體外空氣暴露可逐漸失水和表觀變化，且可為確定采集林麝糞便的排糞時間提供參考。

A.0 d;B.2 d;C.4 d;D.6 d

圖1空氣暴露不同時間的糞便形態

Fig.1 Morphology of feces in different time of air exposure

M.DNA 標準DL 2 000;1～6.樣品

M.DNA Marker DL 2 000;1-6.Sample

圖2糞便PCR檢測結果

Fig.2 PCR result of feces

2.2 高效液相不能有效檢測糞便孕酮

如圖4所示，高效液相檢測孕酮最低分析峰的濃度為32 μg/mL，檢測糞便樣本時沒有峰出現，通過孕酮酶聯免疫試劑盒分析發現,樣本的濃度為460 ng/mL,說明林麝糞便孕酮濃度顯著低于高效液相的最低檢測限，因此高效液相不適用于林麝糞便孕酮的檢測。

圖3 空氣暴露不同時間的糞便失水率

2.3 空氣暴露對孕酮水平的影響

空氣暴露不同時間的糞便提取的孕酮，孕酮含量隨時間延長而減少，其中空氣暴露4 d和6 d的孕酮含量顯著低于0 d(P<0.05)?？諝獗┞? d與0 d相比，孕酮含量降低，但差異不顯著(P>0.05)(圖5)。糞便空氣暴露，孕酮也直接與空氣接觸，同時孕酮在糞便內大量復雜的微生物環境時間也延長，這些因素可能導致孕酮逐漸降解。

A.最低檢測濃度的孕酮色譜峰，箭頭指示孕酮色譜峰；B.高效液相檢測林麝糞便樣本，無分析峰出現

A.Chromatographic peak was detected at lowest concentration of progesterone,arrow indicats the chromatographic peak；B.Sample from feces of forest musk deer was detected by HPLC,chromatographic peak no appears

圖4高效液相檢測孕酮含量

Fig.4 Detection of progesterone level by HPLC

2.4 妊娠期孕酮保持較高水平

連續采集5 d的糞便樣本提取孕酮，發現連續5 d妊娠林麝糞便孕酮含量顯著高于非妊娠林麝，如1 d(P<0.05 )、3 d(P<0.05)和5 d(P<0.05) (圖6)。結果發現，妊娠中期的孕酮含量均高于150 ng/g，而非妊娠個體低于150 ng/g。這證明妊娠著床后，胎盤逐漸代替黃體成為孕酮分泌的主要器官，早期所分泌的孕酮顯著高于非妊娠個體，為后續孕酮診斷方法的優化奠定基礎。

圖5 林麝糞便空氣暴露不同時間與孕激素水平

圖6 妊娠林麝糞便孕酮水平

3 討論

林麝是我國特有的經濟動物，也是我國一級瀕危保護動物，同時也是我國新興的圈養動物。林麝是秋冬季發情的動物，在發情季節交配，如果交配失敗或中途妊娠終止，需要等到下一年的發情期[16]。因此對林麝妊娠的鑒定具有重要意義。確定是否交配成功，除了飼養過程觀察是否發生性行為，就是人為判定發生了交配行為。如果這個發情季節沒有交配成功，則又耽誤了林麝的繁殖機會。林麝的人工授精技術雖然有研究報道，但林麝數量少，市場價值高，這項技術很難進行廣泛應用。因此，對林麝早期妊娠的鑒定，提高繁殖效率尤為重要。孕酮是排卵后顆粒細胞分化而來的黃體細胞分泌的激素，是維持哺乳動物妊娠的重要激素，因此，孕酮是鑒定妊娠的候選因子之一[17]。糞便采集尤其是野外場地的采集，不能及時進行冷凍保存。因此，需要檢測糞便在空氣暴露時間過長是否會影響孕酮含量的檢測。

有研究將新鮮采集的糞便置于甲醇溶液中，置-20℃保存備用。也有研究將提取的孕酮溶解在甲醇中，在-20℃保存不同時間，發現在1個月內沒有顯著降解。也有研究將糞便直接在-20℃保存，孕酮可在相當長的時間保持不變，但反復凍融能影響其濃度[18]。孕酮能在低溫下長期保持與本研究的結果相反，本研究發現，在野外條件下，空氣暴露不同時間，孕酮含量在第4天后顯著下降。關于這方面的研究報道較少，這可能是由于孕酮在糞便復雜微生物及空氣氧化的作用下降解加速[19]。

孕酮用于動物妊娠診斷具有廣闊的應用前景，根據孕酮含量和持續時間可判斷動物的生理狀態。李詠梅[9]用外周血孕酮含量診斷雙峰駝早期妊娠取得了良好效果，診斷成功率達100%。有研究用母豬糞便為材料，用酶聯免疫的方法檢測孕酮含量預測母豬妊娠[20]。有研究認為糞便孕酮濃度大于200 ng/g為妊娠，小于這個濃度為非妊娠[21]，這與我們測定的數據相似(90 ng/g～360 ng/g)。本研究孕酮可作為妊娠檢測的證據，但同時本研究也發現，通過單次檢測糞便孕酮水平評價妊娠狀態誤差較大，需要連續多次檢測。胚胎著床前孕酮主要由黃體分泌，著床后主要由胎盤分泌[22]。正常繁殖周期，孕酮水平也發生周期性變化，受精后孕酮水平不會發生周期性變化，同時還會由于胎盤的分泌補充，孕酮水平增高[23-24]。因此，孕酮作為妊娠鑒定候選因子，主要將妊娠持久黃體分泌孕酮與周期性黃體分泌孕酮區分，這就需要多次檢測，監控孕酮水平，可提高妊娠檢測的準確性。除了妊娠檢測，孕酮水平也可反映繁殖季節野生種群雌性動物的繁殖狀態，這是評價野生動物生態學健康的指標之一[25]。

綜上所述，林麝是新興的圈養經濟動物，林麝早期妊娠診斷是人工繁育的重要環節，目前雖然有研究報道，但技術不成熟，檢測結果不穩定。孕酮是重要的妊娠檢測候選因子，有待繼續探索穩定高效孕酮檢測方法，用于林麝等動物的非損傷性妊娠診斷。