四倍體雜交冰草SRAP和SSR分子標記遺傳連鎖圖譜構建

楊東升，于 卓，于肖夏，李曉宇，吳國芳，石 悅，張明飛

(內蒙古農業大學農學院，內蒙古呼和浩特 010019)

冰草(Agropyron)為禾本科冰草屬多年生草本植物，適應性廣、抗旱性和耐寒性強，是牧草及麥類作物雜交改良和遺傳轉化的寶貴基因資源，具有重要的飼用價值、生態價值和經濟利用價值[1]。但由于冰草種間差異的原因，會表現出一定的缺點，如蒙古冰草(Agropyronmongolicum)葉量少、莖葉比高，品質上有待進一步提升[2]，而航道冰草(Agropyroncristatumcv. Fariway)則可彌補這些不足。四倍體雜交冰草(2n=4x=28)是本課題組以蒙古冰草為母本，航道冰草為父本，通過種間遠緣雜交獲得二倍體雜種F1代，用秋水仙堿溶液進行染色體加倍選育而成的優質牧草[3-5]，結合了父本航道冰草分蘗性強、葉量大、產量高、營養價值高和母本蒙古冰草抗旱耐寒、耐貧瘠及耐風沙等優點[6]。

SSR(simple sequence repeat)標記具有通用性強、穩定性高、基因組內分布范圍廣和標記多呈共顯性等優點[7-8]，常被用于構建植物遺傳連鎖圖譜和分析種質資源的遺傳差異性。SRAP(sequence-related amplified polymorphism)標記是由Li等[9]提出的一種新型分子標記，具有操作簡便、多態性豐富、價格低廉等優點，可有效增加遺傳圖譜的分子標記數。SSR和SRAP標記相結合的技術在植物遺傳作圖研究中已有一些應用，如武耀龍等[10]利用SRAP和SSR標記，成功構建了一張含有128個標記位點的紅麻遺傳連鎖圖譜，圖譜全長為2155.43 cM；朱洪運等[11]用AFLP、SRAP和SSR標記構建出一張高密度結球甘藍分子遺傳連鎖圖譜，該圖譜含有240個標記，覆蓋864.4 cM；郭利建等[12]基于SRAP和SSR標記，通過區間作圖法對三原及楊凌兩個環境下小麥籽粒的淀粉含量、濕面筋含量、粗蛋白質含量和Zeleny沉降值進行了QTL定位。

本課題組姜志艷等[13]利用AFLP標記首次構建了一張含14個連鎖群的四倍體雜交冰草的遺傳圖譜，覆蓋基因組長度2 574.3 cM，標記間平均距離3.82 cM。由于AFLP僅為單分子標記，圖譜加密有限，且預擴增時需進行酶切和連接等過程，其操作復雜且成本高；而SSR與SRAP標記相結合，可使遺傳圖譜上的標記分布更為均勻、精度提高[14]。目前關于SRAP和SSR標記在四倍體雜交冰草遺傳作圖上的研究尚未見報道。本研究以四倍體雜交冰草F2代180個分離單株及其親本為作圖材料[13,15]，利用SRAP和SSR標記技術構建其遺傳連鎖圖譜，以期為冰草AFLP、SRAP和SSR三種標記整合的高密度遺傳圖譜構建，以及產量品質、抗旱耐寒等重要性狀的QTL精細定位、功能基因圖位克隆和分子標記輔助育種研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為四倍體雜交冰草180個F2單株及母本蒙古冰草和父本航道冰草。各材料均種植于呼和浩特市賽罕區內蒙古農業大學農作場。

1.2 DNA的提取與純度檢測

在分蘗期分別取雜交冰草F2代180個單株及親本的幼嫩葉片，剪碎混勻，各取0.15 g于研缽中加液氮充分研磨，利用植物基因組試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取DNA，利用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA純度。將符合要求的基因組DNA稀釋至80 ng·μL-1，置于-40 ℃ 冰箱保存備用。

1.3 SSR和SRAP的引物來源

本試驗所用的108對SSR引物來自NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/probe/)公布的小麥(Tritiumaestivum)、高粱(Sorghumbicolor)及玉米(Zeamays)上已開發的SSR引物。SRAP引物來源于Li等[9]、Pezzotti等[16]及Lin等[17]已報道的引物，其中正向和反向引物均為12條，將其自由組合得到144對引物，委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.4 反應體系及程序

SRAP-PCR體系參考Taq polymerase(紐英倫生物技術(北京)有限公司)說明書，擴增程序為94 ℃預變性5 min；94 ℃變性55 s，35 ℃復性1 min，72 ℃延伸1 min，5個循環；94 ℃變性1 min，50 ℃復性1 min，35個循環；72 ℃延伸8 min，4 ℃保存備用。SSR-PCR體系與程序參考Taq polymerase(紐英倫生物技術(北京)有限公司)說明書，其中循環數為35，退火溫度為57 ℃，延伸時間為1 min。參照石 悅等[18]的方法對擴增產物進行電泳檢測。

1.5 數據統計

多態性位點統計：對SRAP及SSR多態性標記位點進行記錄，有條帶的記錄為“1”，無條帶的記錄為“0”，缺失或條帶不清楚的記錄為“-”，生成“0”和“1”組合的原始矩陣。多態性位點百分率：P=(K/N)×100%，其中K表示多態性位點數目、N表示測定位點總數。

偏分離統計：根據孟德爾分離規律，四倍體雜交冰草F2群體的基因型理論上符合3∶1的分離比，在0.05和0.01的水平上，利用卡方檢驗SRAP和SSR標記多態性位點，判斷每一個被檢測到的多態性位點是否發生偏分離。

1.6 遺傳連鎖圖譜構建

將統計的SRAP和SSR標記位點數據中的“1”和“0”矩陣轉換成軟件要求的目標格式，利用作圖軟件Join Map 3.0構建四倍體雜交冰草F2分離群體的遺傳連鎖圖譜。

2 結果與分析

2.1 SRAP和SSR引物篩選及分子標記多態性分析

以親本及F2群體中的任意3個子代DNA為模板進行適宜引物篩選，在144對SRAP引物自由組合中，共篩選出了10對條帶清晰、多態性高的引物(圖1，圖2)。這10對SRAP引物組合共擴增出267個位點，其中多態性位點為240個，平均每對引物產生24個多態性位點，多態性位點百分率為89.9 %(表1)。

用108對SSR引物對親本及F2子代進行檢測，共得到10對SSR多態性明顯且帶型清晰的引物組合(圖3，圖4)。這些引物組合共產生了277個位點，其中多態性標記位點為235個，平均每對引物組合擴增出23.5個多態性標記位點，多態性位點百分率為84.8 %(表2)。

P1：航道冰草；P2：蒙古冰草；1～3：F2單株。P1:Agropyron cristatum cv. Fariway; P2:Agropyron mongolicum; 1-3:F2 plants.

P1：航道冰草；P2：蒙古冰草；1～40：F2單株群體部分單株P1: Agropyron cristatum cv. Fariway; P2:Agropyron mongolicum; 1-40:Partial F2 individuals.

P1：航道冰草；P2：蒙古冰草；1～3：F2單株。P1:Agropyron cristatum cv. Fariway; P2:Agropyron mongolicum; 1-3: F2 plants.

圖3 四倍體雜交冰草部分SSR適宜引物的篩選結果Fig.3 Screening of suitable SSR primers for tetraploid hybrid crested wheatgrass

P1：航道冰草；P2：蒙古冰草；1～33：F2單株群體部分單株。P1:Agropyron cristatum cv. Fariway; P2:Agropyron mongolicum; 1-33:Partial F2 individuals.

2.2 標記偏分離分析

對獲得的共475個標記位點進行卡方檢測結果顯示，在0.05水平上，其中不符合孟德爾分離比的位點有86個，占總標記數的18.11%。四倍體雜交冰草的14個連鎖群均分布有偏分離標記，偏分離標記數的范圍為2～11，偏分離標記比率的范圍為13.25%～23.81 %，符合植物遺傳作圖的偏分離比率小于30%的要求(表3)。

2.3 遺傳連鎖圖譜的構建

利用軟件Join Map 3.0進行遺傳連鎖圖譜的構建。在LOD≥3.0的條件下，構建出一張包含475個標記(240個SRAP標記+235個SSR標記)、14個連鎖群的四倍體雜交冰草遺傳連鎖圖譜，覆蓋基因組總長度為1592.7 cM，標記間的平均圖距為3.35 cM，各連鎖群長度范圍為67.6～145.2 cM，標記數目在10～83之間，其中標記數目最多且最長的連鎖群為LG2，標記數目最少且最短的連鎖群為LG8(表4，圖5)。

表3 四倍體雜交冰草作圖標記的偏分離分析Table 3 Segregation distortion analysis of mapping markers of tetraploid hybrid crested wheatgrass

表4 四倍體雜交冰草遺傳圖譜的基本特征Table 4 Basic characteristic of the genetic linkage map of tetraploid hybrid crested wheatgrass

*表示偏分離標記。 * represents distorted marker.

3 討 論

高質量的遺傳連鎖圖譜是QTL精細定位、基因圖位克隆及分子標記輔助育種的有效工具[19-20]，因此提高連鎖圖譜的質量顯得尤為重要。圖譜的質量主要取決于分子標記位點在連鎖群上分布的均勻程度，而均勻程度又受限于標記類型，將不同類型的分子標記相結合構建圖譜，會顯著提高標記在圖譜上分布的均勻程度，并有利于克服不同分子標記間的缺陷[21]。例如，金夢陽等[22]通過SRAP、SSR、AFLP和TRAP四種標記構建了一張包含20個連鎖群，共300個標記位點的甘藍型油菜遺傳圖譜，且各標記在圖譜的不同連鎖群上分布較均勻。Hashizume等[23]利用477個RAPD標記、53個RFLP標記及23個ISSR標記，構建了西瓜的遺傳連鎖圖譜，標記位點分布均勻。以上這些標記為第一、二代分子標記，其最大優點是操作簡便、且電泳條帶真實可見，可直接用于作物相關性狀QTL的精細定位研究；其不足點是提供的遺傳信息量有限。隨著近年來基因組測序技術的改進，SNP分子標記技術倍受關注，該標記技術的主要優點是信息檢出量大，易于基因分型；其不足點是SNP等位基因位點在多倍體植物的基因組中的比例具有可變性，很難完成單一型的鑒定，且成本高。

本試驗所用材料為四倍體雜交冰草，基于SRAP標記主要對編碼區進行序列擴增，而SSR標記的大部分擴增區域位于非表達區[24]的特點，同時使用這兩種標記技術對其進行遺傳作圖，可減小標記位點在圖譜上分布的不均勻程度。研究表明，SRAP和SSR兩種標記位點在四倍體雜交冰草的每個連鎖群上分布較均勻，圖譜整體質量有所提高，這為下一步整合AFLP、SRAP和SSR三種標記構建四倍體雜交冰草的高密度遺傳圖譜奠定了基礎。

偏分離現象被認為是生物進化的推動力，在植物界中普遍存在[25]。目前已在大麥[26]、水稻[27]和番茄[28]等作物中發現了偏分離現象 。偏分離比例會因物種和作圖群體類型的不同而有所變化，有多種因素可造成遺傳標記產生不同程度的偏分離現象。Perfectti等[29]認為偏分離是由配子體和合子體共同選擇作用引起的；Pawlowshi等[30]的研究表明，環境因素、基因轉換及轉基因沉默均可能造成偏分離現象的發生。偏分離標記會在一定程度上通過影響標記間的距離來影響圖譜的質量，植物遺傳作圖時通常要求偏分離標記比例小于30%[10]。本試驗得到的475個標記中，有389個標記符合孟德爾分離規律，有86個標記發生偏分離，這些標記不規則地分布于14個連鎖群上，各連鎖群的偏分離標記比例變幅在13.25～23.81 %之間，平均偏分離比例為18.11 %，可進行四倍體雜交冰草的遺傳作圖。