程氏蠲痹湯的抗炎鎮痛作用

牛小雪，陳培柱，杜玉芝，徐紅梅

(合肥工業大學生物與醫學工程學院藥學系，安徽 合肥 230009)

程氏蠲痹湯是清代新安醫家程國彭創立的著名方劑，臨床用于治療痹病十分有效[1-3]，為歷代醫家所推崇。風濕熱、類風濕關節炎相當于中醫學“痹證”范疇。程氏蠲痹湯由羌活、獨活、秦艽、當歸等10味藥材組成，具有祛風除濕、舒筋通絡、活血行滯等功效[4-5]，對類風濕關節炎有較好的療效，但有關其治療類風濕關節炎的實驗研究尚顯不足。本實驗對程氏蠲痹湯的抗炎、鎮痛活性進行評價，為其臨床治療類風濕關節炎提供實驗依據。

1 材料

1.1 試驗藥物 中藥材秦艽(批號 15020703)、羌活(批號 14011505)、獨活(批號 14042504)、川芎(批號 14051601)、當歸(批號 14051401)、海風藤(批號 15020603)、桑枝(批號 14041803)、木香(批號 14031602)、乳香(批號 13112901)和甘草(批號 13050801)為程氏蠲痹湯原方藥物，均購自合肥樂家老鋪中藥材有限公司。

藥材中揮發油成分的提?。喝—毣?、海風藤各100 g，乳香、木香各60 g，投入10 L圓底燒瓶，加入8倍量蒸餾水，熱回流提取2次，收集揮發油，4 ℃遮光儲藏、備用。

藥材中醇溶性、水溶性成分的提?。喝—毣?、川芎、當歸和秦艽各100 g，甘草30 g，羌活60 g和桑枝150 g，用75%乙醇加熱回流提取2次，每次2 h，過濾、濾液濃縮得浸膏A。藥渣再用水煎煮2次，每次2 h，過濾、濃縮得浸膏B。程氏蠲痹湯藥液：合并上述醇提物(A)、水提物(B)和揮發油，減壓濃縮，使藥液的生藥含量為1.02 g/mL，4 ℃遮光儲藏，備用。使用前用0.5%羧甲基纖維素鈉溶液稀釋至1.02、0.51、0.255 g/mL。

雷公藤多苷片(glucosides ofTripterygiumwifordii，GTW；批號 141202)：上海復旦復華藥業有限公司；阿司匹林腸溶片(批號 100901)：廣東九名制藥有限公司。實驗前均用0.5%羧甲基纖維素鈉配制成所需濃度。

1.2 試劑 二甲苯：國藥集團；角叉菜膠(批號 CAS 11114-20-8)：Adamas公司；弗氏完全佐劑(complete Freund’s adjuvant，CFA；批號 CAS 9007-81-2)：Sigma公司。

1.3 儀器 JA 2004 N 型電子天平：上海精密科學儀器公司；YLS-7B足趾容積測量儀：淮北振華公司；RB-200熱板儀：上海益聯科教設備有限公司；打孔器。

1.4 動物 雌性昆明種小鼠[100只，體質量(20±2)g]、雄性昆明種大鼠[96只，體質量(180±20)g]：均由安徽醫科大學實驗動物中心[生產許可證號為SCXK(皖)2017-001]提供。

2 方法

2.1 程氏蠲痹湯對熱板致痛小鼠痛閾的影響 取雌性昆明種小鼠，放在(55.0±0.5)℃的金屬熱板上，測定每只小鼠的痛閾值(即疼痛反應潛伏期，指小鼠接觸熱板至舔后足的時間)，痛閾在5～30 s內為痛閾正常小鼠。取痛閾正常小鼠50只，隨機分為空白組，阿司匹林組(0.05 g/kg)，程氏蠲痹湯高劑量(20.40 g/kg，相當于60 kg成人臨床用藥量的24倍)、中劑量(10.20 g/kg)、低劑量(5.10 g/kg)組。各組小鼠灌胃給藥，每日1次，連續7 d，空白組小鼠給予等容積溶媒。末次給藥1 h后，以小鼠出現舔后足行為作為疼痛反應指標，記錄自投入熱板至出現舔后足的潛伏期，連續測量3次，取平均值為痛閾。鎮痛效應的計算公式：痛閾提高百分率=[(給藥后痛閾-給藥前痛閾)/給藥前痛閾]×100%。

2.2 程氏蠲痹湯對小鼠急性炎癥耳腫脹度的影響 取雌性昆明種小鼠50只，分組與給藥同“2.1”項。末次給藥1 h后，將0.025 mL二甲苯均勻涂抹于小鼠左耳正反兩面，以右耳為對照，復制小鼠急性炎癥模型。致炎30 min后，將小鼠頸椎脫臼處死，用直徑9 mm的打孔器，在左右耳廓相同部位打孔取樣，及時稱量耳片質量，計算耳腫脹度(左右耳片質量差值)及耳腫脹抑制率。耳腫脹抑制率=[(模型組平均腫脹度-給藥組平均腫脹度)/模型組平均腫脹度] ×100%。

2.3 程氏蠲痹湯對大鼠急性炎癥足腫脹率的影響 取雄性SD大鼠48只，隨機分為6組，分別為正常組、模型組、GTW組(0.01 g/kg)和程氏蠲痹湯高劑量(10.20 g/kg)、中劑量(5.10 g/kg)、低劑量(2.55 g/kg)組。各組大鼠灌胃給藥，正常組和模型組均灌胃等容量空白溶劑，每日1次，連續14 d。末次給藥后1 h，于大鼠左后足踝關節處作標記，測量大鼠足體積。除正常組外，在其他組大鼠左后足跖皮內注射0.1 mL角叉菜膠溶液復制炎癥模型，并于致炎后1、2、4、6 h分別測定大鼠左后足體積。足腫脹率=[(Vt-Vn)/Vn]×100%，Vn、Vt分別代表大鼠致炎前、致炎后足體積。

2.4 程氏蠲痹湯對大鼠慢性炎癥足腫脹率和屈關節疼痛評分的影響 動物分組及給藥同“2.3”項。除正常組外，其余各組大鼠均于左后足跖皮內注射0.1 mL CFA復制佐劑性關節炎(adjuvant arthritis，AA)模型。致炎后第15天灌胃給藥，每日1次，連續14 d。

2.4.1 足腫脹度的檢測 在致炎前及致炎后第14、17、20、22、25、28天分別測量各組大鼠的左后足體積及繼發側足體積，并計算各組大鼠足腫脹率，計算方法同“2.3”項。

2.4.2 屈關節疼痛評分(縮腿嘶鳴評分) 在致炎第0、5、14、20、26天，進行背屈和趾屈關節疼痛實驗評分。具體如下：用固定器將大鼠頭部固定，使其兩后腿和尾部伸出，穩定后進行測定。①趾屈：將大鼠左側踝關節向腳掌側緩慢且柔和彎曲，每間隔5 s進行一次，共5次。若大鼠出現短促而明顯的縮腿或嘶叫反應則評分為1，無反應評分為0。分別記錄其縮腿和嘶叫評分，每種指標的評分為0～5分，兩種指標的評分相加，每只大鼠的總評分為0～10分。②背屈：將大鼠左側踝關節向腳背側緩慢且柔和彎曲，評分方法同趾屈關節評分。用縮腿和嘶叫二者的總評分來反映大鼠關節疼痛的程度。

3 結果

3.1 程氏蠲痹湯對小鼠痛閾的影響 與空白組比較，給藥組小鼠更耐痛，痛閾提高百分率顯著上升(P<0.05)；其中程氏蠲痹湯高、中劑量組痛閾提高百分率與阿司匹林組相近，差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 程氏蠲痹湯對小鼠痛閾的影響

注：與空白組比較，*P<0.05；與阿司匹林組比較，#P<0.05

3.2 程氏蠲痹湯對小鼠耳腫脹度的影響 與空白組比較，二甲苯致炎后，阿司匹林組和程氏蠲痹湯高、中劑量組小鼠耳腫脹度顯著降低(P<0.05)；程氏蠲痹湯低劑量組對小鼠耳腫脹的抑制率顯著低于阿司匹林組(P<0.05)，而其高、中劑量組藥效與阿司匹林組的差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

3.3 程氏蠲痹湯對大鼠急性炎癥足腫脹率的影響 角叉菜膠致炎1 h后，即可引起模型組大鼠足部顯著腫脹(P<0.05)；在致炎后各時間段，GTW組和程氏蠲痹湯高、中劑量組大鼠的足腫脹率均顯著低于模型組(P<0.05)，且致炎后4 h效果最為顯著；程氏蠲痹湯低劑量組大鼠足腫脹率在致炎后2～6 h與GTW組的差異有統計學意義(P<0.05)，而其高、中劑量組與GTW組的差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表2 程氏蠲痹湯對小鼠耳廓腫脹度的影響

注：與空白組比較，*P<0.05；與阿司匹林組比較，#P<0.05

表3 程氏蠲痹湯對大鼠急性炎癥足腫脹率的影響

注：與正常組比較，△P<0.05；與模型組比較，*P<0.05；與GTW組比較，#P<0.05；與致炎1 h后比較，aP<0.05；與致炎2 h后比較，bP<0.05；與致炎4 h后比較，cP<0.05

3.3 程氏蠲痹湯對AA大鼠疼痛與足腫脹率的影響 AA大鼠在致炎后第14 d，其原發側和繼發側足腫脹率、屈關節疼痛評分明顯高于正常組(P<0.05)；與模型組比較，致炎后第20天，GTW組和程氏蠲痹湯高、中劑量組大鼠原發側及繼發側足腫脹率和屈關節疼痛評分明顯降低(P<0.05)；且程氏蠲痹湯高、中劑量組大鼠足腫脹率和屈關節疼痛評分與GTW組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表4、表5。

表4 程氏蠲痹湯對AA大鼠原發側和繼發側足腫脹率的影響

注：與正常組比較，△P<0.05；與模型組比較，*P<0.05；與GTW組比較，#P<0.05

4 討論

炎癥是機體對損傷因子所發生的防御反應，根據持續時間不同分為急性和慢性。急性炎癥以發紅、腫脹、疼痛等為主要癥狀，而慢性炎癥可由急性炎癥遷延而來，病程較長，且臨床表現多樣，診斷及治療相對困難。類風濕關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種自身免疫性疾病，其基本病理是由免疫失控所引發的慢性滑膜炎癥，主要表現為關節腫痛、僵直，屈伸不利[6-7]。持續的慢性炎癥可引發關節軟骨和骨質的損害，導致患者關節畸形，給患者帶來極大的痛苦。目前臨床上對RA的治療主要是緩解急性發作癥狀(如關節疼痛和腫脹)，抑制炎性因子的釋放以及提高機體免疫抑制功能等。中醫藥因其治療RA療效確切，毒性和不良反應較小而引起醫學界的極大關注。

表5 程氏蠲痹湯對AA大鼠縮腿嘶鳴評分的影響

注：與正常組比較，△P<0.05；與模型組比較，*P<0.05；與GTW組比較，#P<0.05

現代藥理學研究表明，程氏蠲痹湯方中秦艽具有良好的抗炎、鎮痛作用，可調節機體炎性因子如腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-1β和白細胞介素-4的表達[8-9]。海風藤提取物可以通過降低大鼠滑膜組織中腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-6、核因子-κB、核因子-κB抑制因子和核因子-κB激酶抑制因子及其mRNA的表達，發揮其抗炎、抗風濕作用[10]。桑枝、木香可通經活絡，佐以當歸、川芎、乳香可理氣養血、活血行滯。許霞等[11]研究發現，程氏蠲痹湯加減方含藥血清可以下調AA大鼠外周血單核細胞腫瘤壞死因子-α和白細胞介素-1β的水平。但程氏蠲痹湯的抗炎鎮痛作用及其對類風濕關節炎的治療效果卻鮮見報道。本實驗通過熱板法和二甲苯致炎法[12-13]考察程氏蠲痹湯對小鼠的抗炎鎮痛效果；利用角叉菜膠[14]和弗氏完全佐劑復制大鼠炎癥模型，分別評價程氏蠲痹湯對大鼠急性和慢性炎癥的療效。結果顯示，20.40、10.20 g/kg程氏蠲痹湯可顯著提高小鼠的痛閾，抑制急性耳腫脹，10.20、5.10 g/kg程氏蠲痹湯可顯著緩解大鼠炎性足腫脹，并減輕AA大鼠屈關節疼痛。結果表明，程氏蠲痹湯對小鼠、大鼠的急性和慢性炎癥均具有良好的抗炎、鎮痛效果。本研究結果可為程氏蠲痹湯治療RA提供實驗依據，但其抗炎鎮痛的機制尚待進一步研究。