基于網絡藥理學的二至丸作用機制研究

劉春柳，王炳權，李 玲，曹璐璐，孫照東

(1.天津中醫藥大學研究生院，天津 300193； 2.天津中醫藥大學中醫學院，天津 300193)

二至丸出自清·汪昂所著的《醫方集解》[1]，由女貞子、墨旱蓮1∶1配伍而成，偏于甘涼，歸肝、腎經，主治肝腎陰虛證，治宜滋補肝腎，素有“清上補下第一方”之美譽，被廣泛應用于肝膽、腎臟、婦科及消化等各科[2]，簡便廉驗，鮮見不良反應的報道?，F代藥理研究結果表明，二至丸具有抗炎、抗惡性腫瘤、抗氧化、調節免疫及改善血流變等諸多功效[3]。然而，中藥具有多成分、多靶點和系統調節的特點，動物、細胞等基礎實驗雖可對某一機制進行研究，但難以展現中藥復方的系統性。近年來，隨著對中藥藥理研究的日益深入，生物信息學與系統生物學的飛速發展，單成分、單靶點研究思路向整體探究、系統調節轉變[4]。網絡藥理學從多靶點相互聯系角度闡釋中藥配伍規律與作用機制，與中醫藥整體觀念不謀而合，為探析“中藥-成分-靶點-疾病”多層次作用機制提供了新的研究思路[5]?；诖?，本文通過網絡藥理學辨識二至丸有效成分、預測潛在靶點及相關疾病等信息，從分子層面系統分析其多層次作用網絡。

1 資料與方法

1.1 二至丸成分、靶點及相關疾病的查詢與篩選

將女貞子、墨旱蓮分別輸入中藥系統藥理學數據庫(traditional Chinese medicine systems pharmacology database，TCMSP)(http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmspsearch.php)，將口服生物利用度(oral bioavailability，OB)設置為≥30%，類藥性指數(drug like index，DL)設置為≥0.18，查詢并篩選該數據庫中所包含的上述2味中藥的有效活性成分及毒藥物動力學(absorption,distribution,metabolism and excretion，ADME)信息[6]，將所得信息錄入Excel表格。此外，在TCMSP平臺獲得篩選所得的化學成分對應的靶點蛋白，并進一步獲取靶點對應的相關疾病，剔除無對應靶點成分，刪除重復靶點及相關疾病信息，將獲取信息錄入Excel表格。在Uniprot(http：//www.uniprot.org/)中的Uniprot KB數據庫檢索篩選所得靶點的對應基因，將檢索條件設置為Organism： Homo sapiens(Human)，利用Excel表格“中VLOOKUP”函數匹配靶點蛋白對應的基因信息。獲得成分-靶點基因、靶點基因-疾病數據表格。

1.2 網絡構建及核心靶點篩選

將二至丸“成分-靶點基因”“靶點基因-疾病”數據導入Cytoscape 3.2.1軟件，對數據進行分析并將數據圖形化以網絡圖展示，中藥成分、靶點基因和相關疾病為網絡節點，彼此之間的相互聯系為節點之間的連線，并通過該軟件插件CytoNCA[7]進行拓撲分析，根據節點度(Degree)和中介中心度(betweenness centrality,BC)篩選出二至丸潛在的核心靶點與主要治療疾病。節點度及中介中心度排序是網絡分析中確定網絡關鍵節點的主要方法之一，節點度及中介中心度越高，節點在該網絡中作用越重要[8]。

1.3 基因通路與功能分析

采用Cytoscape 3.2.1的插件Clue GO對二至丸的成分作用靶點進行基因本體(gene ontology，GO)分類富集分析、基于京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)的通路富集分析[9]。

2 結果

2.1 二至丸有效成分、對應靶點及相關疾病信息

在OB≥30%，DL≥0.18的篩選條件下，獲得女貞子有效成分13種，墨旱蓮10種，其中木犀草素(luteolin)、槲皮素(quercetin)為2藥共有，故最終獲得二至丸中有效成分21種，見表1。21種有效成分中，有4種未找到對應靶點，其余17種獲得潛在靶點225個，其中7個靶點蛋白為非人源基因，故獲得靶點基因218個，具有相關疾病的靶點105個，獲得靶點對應疾病301種。

2.2 “成分-靶點”“靶點-疾病”網絡

二至丸的“成分-靶點”的網絡圖見圖1。該圖包含節點235個(深色節點為成分，淺色節點為靶點)，邊線407條，其中成分平均Degree為23.94，大于平均Degree的成分有5個，其中Degree最高者為槲皮素(quercetin)，其余依次為木犀草素(luteolin)、山奈酚(kaempferol)、β-谷固醇(beta-sitosterol)和刺槐素(acacetin)。槲皮素、木犀草素、山奈酚和刺槐素具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、抗血小板聚集及調節免疫保護神經等多種藥理作用[10-14]；β-谷固醇是植物固醇，普遍認為其具有良好的降血脂作用[15]。二至丸的“靶點-疾病”網絡圖中含有節點406個(深色節點為疾病，淺色節點為靶點)，邊線572條，其平均Degree為2.81，BC為1 314.15，見圖2。根據平均Degree與BC衡量靶點基因與疾病的重要性，得出Degree≥13，BC≥1 314.15的核心靶點10個，包括前列腺素G/H合酶2(PTGS2)、花生四烯酸5脂氧合酶(Alox5)、過氧化物酶體增殖因子活化受體γ(PPARG)、肝臟藥物代謝酶(CYP1A2)、絲裂原活化蛋白激酶14(MAPK14)、周期蛋白依賴激酶(CDK2)、谷胱甘肽硫轉移酶P1(GSTP1)、表皮生長因子受體(EGFR)、β2腎上腺素受體(ADRB2)及基質金屬蛋白酶2(MMP2)；獲得重要相關疾病12種，包括癌癥、炎癥、肺部及精神性疾病等多種疾病類型，見表2。

表1 二至丸有效成分的基本信息(OB≥30%，DL≥0.18)Tab 1 Main active ingredients of Erzhi pills (OB≥30%,DL≥0.18)

圖1 二至丸“成分-靶點”網絡圖Fig 1 Components-targets network of main active ingredients of Erzhi pills

圖2 二至丸“靶點-疾病”網絡圖Fig 2 Targets-diseases network of main active ingredients of Erzhi pilll

表2 二至丸“靶點-疾病”拓撲參數表(Degree≥6，BC≥2 040)Tab 2 Topological parameters of related diseases of Erzhi pills (Degree≥6,BC≥2 040)

2.3 基因功能分析

通過Clue GO插件對篩選的二至丸潛在靶點進行生物學過程富集分析，可見二至丸的靶點影響了991個生物學過程，主要富集過程有活性氧代謝過程的調控(regulation of reactive oxygen species metabolic process)、活性氧代謝過程的正調控(positive regulation of reactive oxygen species metabolic process)、氧化應激反應(response to oxidative stress)、細胞趨化作用(cell chemotaxis)、一氧化氮代謝過程(nitric oxide metabolic process)、調節系統過程(regulation of system process)及雌二醇反應(response to estradiol)等，見圖3。應用Clue GO中的KEGG代謝通路富集分析，設定P<0.01，二至丸作用通路共36條，主要代謝通路富集于流體剪切力與動脈粥樣硬化(fluid shear stress and atherosclerosis)、神經活性配體-受體相互作用(neuroactive ligand-receptor interaction)、補體與凝血相互作用(complement and coagulation cascades)及縫隙連接(gap junction)等，顯著富集通路包括尼古丁成癮(nicotine addiction)、膀胱癌(bladder cancer)、糖尿病并發癥中晚期糖基化終產物(advancedend-products，AGE)-AGE受體(the receptor of AGE，RAGE)信號通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)及白細胞介素17信號通路(IL-17 signaling pathway)等，見圖4。

圖3 基因生物功能分析Fig 3 Gene biological function analysis

圖4 代謝通路分析Fig 4 Metabolic pathway analysis

3 討論

中醫藥診療歷經千年，經驗豐富，優勢明顯，但其物質基礎與作用機制不明確。中藥方劑是傳統醫學的應用體系，是中醫基礎理論的載體，也是一個繁復的化學系統。網絡藥理學綜合中藥藥理學、基因組學、蛋白組學及代謝組學等多學科生物信息，將中藥多成分、多靶點和多途徑的復雜作用關系通過網絡學科語言呈現出來，突破了單靶點研究模式的束縛，有利于中藥配伍規律及作用機制的探究，為中醫藥的科學發展與創新提供了新的思路與方法[16]。

根據網絡藥理學的相關理念與技術，本研究對二至丸的作用機制進行了預測，篩選所得有效化學成分21種，得到潛在對應靶點225個，相關疾病301種，且女貞子、墨旱蓮中均含有犀草素、槲皮素，這2種有效成分作用相似，Degree高，對應靶點可通過抗惡性腫瘤、抗炎和抗氧化來治療多種惡性腫瘤及炎癥。本研究結果提示,二至丸可同時作用于多個作用靶點，治療多種疾病，以惡性腫瘤居多，體現了中醫“異病同治”的治療特點。在龐大信息數據基礎上繪制“成分-靶點”“靶點-疾病”網絡圖，直觀地展現了二至丸治療疾病的多重機制與相互關聯。對二至丸潛在靶點進行生物信息富集分析的結果顯示，二至丸可影響991個GO生物學過程以及36條代謝通路；顯著富集結果顯示，二至丸治療疾病可能與對氧代謝、氧化應激反應等生物過程的調節及對惡性腫瘤、炎癥通路的影響密切相關，多生物學過程與代謝通路為深入探討二至丸的作用機制、拓展臨床應用提供了科學依據。相關研究結果發現，二至丸可通過PI3K/Akt/RAPTRO/RICTROR信號通路保護肝細胞，抑制其凋亡[17]；趙雪瑩等[18]的研究結果顯示，二至丸可降低大鼠腦組織線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ、Ⅳ含量，從而提高機體抗氧化能力；研究結果表明，二至丸防治腫瘤機制與其調節腫瘤免疫逃逸和免疫編輯等作用相關[19]。本研究預測的靶點與疾病、基因功能分析等結果與現有研究報道一致，體現了網絡藥理學預測靶點的準確性，為二至丸的深入研究、拓展應用奠定了基礎。

綜上所述，本研究對二至丸的作用機制作出了基本預測，但并不能全面展現二至丸的作用機制。通過數據庫對二至丸篩選的有效成分有限，故據此預測靶點具有一定的局限性。二至丸對于某些疾病的治療效果尚缺乏臨床實踐佐證，通過網絡藥理學預測獲得的靶點及途徑亦需要基礎實驗的驗證。