高效液相色譜法同時檢測化妝品中12種直接染料

潘 城, 吳 凌, 謝 勇, 許文琪, 白 洋, 黃永輝, 胡朝陽

(福建省產品質量檢驗研究院, 福建 福州 350002)

著色劑可賦予化妝品美麗的顏色,對化妝品起到美化、修飾的作用,因此廣泛應用于化妝品特別是彩妝產品。但是化妝品中使用的著色劑多數是合成工業染料,可引起眼睛、口腔、皮膚等部位發炎,影響人體內分泌和生殖系統,甚至誘發癌癥,長期或過量使用會對人體健康產生潛在危害[1]。直接染料是工業合成染料中一大類活性較強的染料,由于大多數為偶氮類結構,具有致癌、致突變作用,直接染料品種被禁用數量居各染料品種之首[2,3]。近年來,世界范圍內均致力于開發利用各種天然或功能性材料用以吸附降解環境中的直接染料,降低其對環境和人體的風險[4-15]。歐盟和我國也相繼出臺了化妝品中直接染料的禁限用規定。歐盟化妝品法規[16]禁用組分列表中涉及的直接染料有直接黃12、直接紅81、直接紅80、直接紅23、直接黑51、直接紅28、直接黑38、直接棕95、直接藍6和直接紫48;限用表中涉及的有直接橙39,其專用于僅和皮膚暫時接觸的化妝品。我國《化妝品安全技術規范》(2015年版)[17]禁用列表中涉及的直接染料有直接黃12、直接紅81、直接紅80、直接紅23、直接黑51、直接紅28、直接黑38、直接棕95、直接藍6和直接紫48,限用表中涉及的有直接橙39,其專用于僅和皮膚暫時接觸的化妝品。

目前對直接染料的檢測方法大多采用分光光度法[18]、液相色譜-質譜聯用法[19-28]和高效液相色譜法[29-35]。分光光度法靈敏度較差,無法同時對多種直接染料進行定量分析;液相色譜-質譜聯用儀價格昂貴,檢測成本高,難以普及應用;高效液相色譜法已應用于工業合成染料的檢測中,具有檢測成本低、適合高通量分析、定量準確可靠等優點。當前,直接染料主要研究對象集中在食品、紡織品、水體、藥材等方面,且只針對一種或幾種直接染料進行分析,無法滿足現代分析高通量篩查的需求,化妝品中多種禁限用直接染料的高通量分析檢測方法還未見報道。

本文針對化妝品中12種直接染料,采用C18柱進行梯度洗脫分離,以乙腈-0.02 mol/L乙酸銨水溶液(pH 9.0)為流動相,經高效液相色譜法檢測,建立了高效、準確、快速、靈敏的化妝品中多種直接染料同時分離檢測的技術,為化妝品中直接染料的檢測和監管提供技術支撐。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Waters 2695高效液相色譜儀配二極管陣列檢測器(美國Waters公司); Milli-Q超純水純化系統(美國Millipore公司);渦旋混合器(江蘇健康醫藥公司); Avanti J-E高速冷凍離心機(美國貝克曼公司);分析天平(0.1 mg,賽多力科(北京)科學有限公司)。

乙酸銨(優級純,上海生工生物工程有限公司);乙腈、甲醇(色譜純,山東禹王實業有限公司化工分公司);三氯甲烷、無水乙醇、正己烷(優級純,上海生工生物工程有限公司)。直接染料標準品:直接紅28(純度98%, CAS No. 573-58-0)購自德國CNW科技公司;直接棕95(純度100%, CAS No. 16071-86-6)和直接藍6(純度100%, CAS No. 2602-46-2)購自德國Dr. Ehrenstorfer公司;直接黑38(純度98%, CAS No. 1937-37-7)購自百靈威科技有限公司;直接黃12(純度100%, CAS No. 2870-32-8)、直接紅80(純度100%, CAS No. 2610-10-8)、直接藍1(純度100%, CAS No. 2610-05-1)購自梯希愛(上海)化成工業發展有限公司;直接紅81(純度98%, CAS No. 2610-11-9)購自山東西亞化學工業有限公司;直接紅23(純度99%, CAS No. 3441-14-3)購自上海一研生物科技有限公司;直接橙39(純度100%, CAS No. 1325-54-8)購自上海將來生化試劑有限公司;直接黑51(純度95%, CAS No. 3442-21-5)購自美國Amresco公司;直接紫48(純度98%, CAS No. 37279-54-2)購自日本純和藥業公司。0.20 μm聚四氟乙烯(PTFE)膜購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司,0.45 μm聚醚砜水相膜和尼龍膜購自天津市津騰實驗設備有限公司。

1.2 標準溶液的配制

稱取適量各染料標準品,置于100 mL容量瓶中,用0.02 mol/L乙酸銨水溶液(pH 9.0)溶解并定容至刻度,配制成質量濃度為490～4 077 mg/L的混合標準儲備液;用0.02 mol/L乙酸銨水溶液(pH 9.0)逐級稀釋混合標準儲備液,配制質量濃度為0.2～408 mg/L的8個系列混合標準工作液,于4 ℃冰箱中保存。

1.3 樣品前處理

1.3.1膏狀、粉狀等固體樣品和指甲油樣品

稱取試樣1.0 g(精確至0.000 1 g),置于50 mL螺紋蓋離心管中(膏狀樣品用玻璃棒均勻涂抹在離心管底部),加入25 mL三氯甲烷,渦旋溶解分散樣品,隨后加入0.02 mol/L乙酸銨溶液(pH 9.0)10 mL,液液萃取5 min,以10 000 r/min離心5 min后,取上層水相溶液,過0.20 μm PTFE濾膜,濾液供液相色譜測定。

1.3.2水狀液體樣品

稱取試樣1.0 g(精確至0.000 1 g),置于25 mL具塞比色管中,用0.02 mol/L乙酸銨溶液(pH 9.0)稀釋定容至10 mL,混勻,過0.20 μm PTFE濾膜,濾液供液相色譜測定。

1.4 色譜條件

色譜柱:XB-C18柱(150 mm×4.6 mm, 5 μm,美國Welch公司);柱溫:35 ℃;流速:1. 0 mL/min;流動相:(A)乙腈和(B)0.02 mol/L乙酸銨水溶液(pH 9.0)。洗脫梯度程序:0～3.0 min, 3%A; 3.0～15.0 min, 3%A～30%A; 15.0～30.0 min, 30%A～38%A; 30.0～35.0 min, 38%A～60%A; 35.0～35.1 min, 60%A～3%A; 35.1～40.0 min, 3%A。進樣量:20 μL;檢測器:光電二極管陣列檢測器;檢測波長:404 nm(直接黃12)、508 nm(直接紅80、直接紫48、直接紅81、直接紅23、直接紅28、直接橙39和直接棕95)和625 nm(直接藍6、直接藍1、直接黑51和直接黑38)。

圖 1 采用不同色譜柱時12種直接染料的色譜圖Fig. 1 Chromatograms of the 12 direct dyes using different chromatographic columns 1. direct red 80; 2. direct blue 6; 3. direct blue 1; 4. direct violet 48; 5. direct red 81; 6. direct red 23; 7. direct red 28; 8. direct orange 39; 9. direct brown 95; 10. direct black 51; 11. direct yellow 12; 12. direct black 38.

2 結果與討論

2.1 檢測波長的選擇

為了考察檢測波長對目標化合物檢測靈敏度的影響,二極管陣列檢測器在190～800 nm范圍內對12種直接染料進行光譜掃描。12種直接染料分別在404 nm(直接黃12)、508 nm(直接紅80、直接紫48、直接紅81、直接紅23、直接紅28、直接橙39、直接棕95)和625 nm(直接藍6、直接藍1、直接黑51、直接黑38)處有較大吸收。因此,本實驗采用多波長檢測,檢測波長分別為404、508和625 nm。

2.2 色譜條件的優化

2.2.1色譜柱的選擇

如圖1所示，實驗比較了Symmetry-C18(150 mm×4.6 mm, 5 μm)和Ultimate XB-C18(150 mm×4.6 mm, 5 μm)色譜柱對12種直接染料的分離效果。直接紅81和直接紅23在Symmetry-C18色譜柱上無法分離;各目標物在Ultimate XB-C18色譜柱上均能實現良好分離,且靈敏度更高,峰形更尖銳。因此本實驗選用Ultimate XB-C18色譜柱作為分離色譜柱。

圖 2 采用不同流動相時12種直接染料的色譜圖Fig. 2 Chromatograms of the 12 direct dyes using different mobile phases a. acetonitrile-water; b. methanol-0.02 mol/L ammonium acetate solution (pH 9.0); c. acetonitrile-0.02 mol/L ammonium acetate solution (pH 9.0). Peak Nos. 1-12 were the same as in Fig. 1.

2.2.2流動相的選擇

實驗比較了乙腈-純水、甲醇-0.02 mol/L乙酸銨水溶液和乙腈-0.02 mol/L乙酸銨水溶液(pH 9.0)3種流動相體系的分離效果,結果見圖2。采用乙腈-純水時,12種直接染料的峰形和分離度均不理想;采用甲醇-0.02 mol/L乙酸銨水溶液(pH 9.0)時12種直接染料出峰較慢,且分離度不理想;采用乙腈-0.02 mol/L乙酸銨水溶液(pH 9.0)時12種直接染料均有良好的峰形和分離效果。因此本實驗選擇乙腈-0.02 mol/L乙酸銨溶液(pH 9.0)作為流動相。

2.2.3流動相pH值的選擇

考察了不同pH值(3.5、4.5、5.5、6.5、7.5、8.5、9.0和9.5)的0.02 mol/L乙酸銨水溶液對12種直接染料分離效果的影響,結果見圖3。結果表明,當pH值低于9.0時,直接紅80和直接黑51峰形和靈敏度較差,甚至有不出峰情況,直接棕95峰形脫尾嚴重;當pH值增加至9.0,所有目標物峰形均得到明顯改善,同時靈敏度提高,再繼續增加pH值,各目標物分離效果和靈敏度無明顯變化。由于XB-C18色譜柱最佳pH范圍為1.0～10.0,故選擇pH值9.0的0.02 mol/L乙酸銨水溶液-乙腈體系作為流動相。

圖 3 采用不同pH值的流動相時12種直接染料的色譜圖Fig. 3 Chromatograms of the 12 direct dyes using different pH values of mobile phasesPeak Nos. 1-12 were the same as in Fig. 1.

2.3 樣品前處理條件的優化

2.3.1樣品溶解液的選擇

考察了甲醇、乙腈、正己烷、乙醇、三氯甲烷、四氫呋喃等對1.0 g口紅、粉餅和指甲油等樣品的分散溶解情況。結果表明,甲醇、乙醇、乙腈、正己烷均無法溶解樣品,四氫呋喃能溶解膏狀樣品,但其溶解后與水相提取溶液互溶,帶入更多干擾物質,且易堵塞色譜柱,導致色譜柱損壞過快。三氯甲烷對膏狀化妝品等固體樣品具有良好的溶解分散作用,但是一定量的三氯甲烷試劑僅能溶解對應量的樣品。因此考察了不同用量(5、10、15、20、25、30和35 mL)的三氯甲烷對1.0 g樣品的分散溶解情況。結果表明,三氯甲烷用量為25 mL時即可使樣品完全分散溶解。因此選擇加入25 mL三氯甲烷。

2.3.2不同提取試劑的選擇

考察了10 mL甲醇、乙酸銨(pH 9.0)和純水對加標口紅、粉餅樣品中12種直接染料的萃取效率。結果顯示,采用10 mL乙酸銨(pH 9.0)時提取效率最佳,回收率為90.6%～102.4%;純水的提取效率較低,回收率為12.6%～110.0%;甲醇與三氯甲烷發生互溶,使得液液萃取操作無法進行。因此本實驗選擇10 mL乙酸銨(pH 9.0)進行液液萃取。

2.3.3吸附濾膜的選擇

考察了不同材質濾膜對樣品溶液中12種直接染料的吸附性情況。結果表明,PTFE膜對12種直接染料吸附性效果均較差,吸附率在5%以下;聚醚砜水相膜對直接紅28、直接黑38、直接黑51等吸附性效果較好,吸附率均大于30%;尼龍膜表現出極強的吸附性能,對絕大多數直接染料吸附率為100%,因而選擇PTFE膜進行樣品過濾操作。

2.4 標準曲線、線性范圍、相關系數及檢出限

配制系列混合標準溶液,以各分析物的峰面積(Y)和相應的質量濃度(X, mg/L)繪制標準曲線,得到線性回歸方程。結果表明,各目標物在線性范圍內12種染料的線性關系良好,相關系數(r)>0.999(見表1)。以3倍和10倍信噪比確定方法的檢出限和定量限。結果表明,12種直接染料的檢出限范圍為0.017～1.7 μg/g,定量限范圍為0.058～5.6 μg/g。

表 1 12種直接染料的回歸方程、線性范圍、相關系數、檢出限及定量限

Y: peak area;X: mass concentration, mg/L.

2.5 回收率和精密度

以空白基質樣品進行3個水平的加標回收試驗,每個水平平行測定6次。結果表明,12種直接染料的平均加標回收率為85.6%～113.4%,相對標準偏差(RSD)為1.0%～7.7%(見表2)。說明該方法具有良好的準確度和精密度,可用于化妝品中直接染料的日常分析檢測。

2.6 穩定性

取高、中、低3個質量濃度的直接染料混合標準溶液,于室溫下放置2、4、6、8、12 h和1～6 d,考察直接染料混合標準溶液的日內和日間穩定性。結果表明,高、中、低3個質量濃度的直接染料的日內精密度分別為0.4%～2.4%、0.6%～4.8%和0.5%～6.5%;日間精密度分別為0.2%～3.7%、1.9%～6.7%和1.7%～7.5%。由此可見,12種直接染料混合標準溶液穩定性較好。

2.7 實際樣品分析

應用本方法分別對水劑類、粉類、棒狀類等市售的不同類型、不同批次的化妝品樣品共計25件進行測定，結果均未檢測出直接染料化合物。

3 結論

本文建立了高效液相色譜同時分離檢測化妝品中12種直接染料的方法。該方法具有操作簡單、靈敏度高和通量高等特點,可滿足化妝品企業、進出口檢驗檢疫部門、化妝品質量監督部門對不同類型化妝品中直接染料的檢測要求,為我國化妝品質量管理監控提供必要的技術支持和方法依據。