布魯氏菌MLVA-15分型方法的建立

王 勛，米吉提·莫合他爾汗，孫明軍，狄棟棟，許 芳，賈舒安，顏成旭，李金平，范偉興，曾巧英*

(1.甘肅農業大學動物醫學院，蘭州730070；2.新疆動物衛生監督所，烏魯木齊830000；3.中國動物衛生與流行病學中心，山東青島 266032)

布魯氏菌病(簡稱布病)是由布魯氏菌引起的一種危害嚴重的人獸共患傳染病。在目前已知的6個經典布魯氏菌種中[1]，對我國畜牧業造成重大危害并能引起人致病的主要為羊種布魯氏菌(B.melitensis)[2]，其次是牛種布魯氏菌(B.abortus)和豬種布魯氏菌(B.suis)[3]。而羊種布魯氏菌三個生物型(1、2、3型)中，最常見的是生物3型，占整個羊種分離菌株的80%以上。布魯氏菌在遺傳上高度保守，而我國流行菌株的種型相對單一，因而，建立一個分辨力高的布魯氏菌鑒別方法對布病流行病學調查尤其是病原追溯是非常必要的。

由于傳統的布魯氏菌種型鑒定方法過程繁瑣、人員感染風險較高，因而以核酸分子為基礎的基因型分析方法越來越受到重視。多位點可變數目串聯重復序列分析(Multi-locus VNTR Assay，MLVA)和多位點序列分析(multi-locus sequence analysis，MLSA)是目前國際上主要的布魯氏菌分子分型方法?；?6個可變數目串聯重復序列(Variable-Number of Tandem-Repeats，VNTR)位點的MLVA分型方法(MLVA-16)具有較高的分辨力且最為常用[3-4]，可用于地域關系比較遠的布魯氏菌分離株的鑒別和遺傳關系分析，但對于遺傳關系較近的菌株區分能力較弱；包含21個看家基因的MLSA分型方法(BruMLSA21)對不同種的布魯氏菌菌株具有很好的區分能力[5-7]，但對于同一種型的布魯氏菌的區分能力還是很低。我國布魯氏菌流行菌株的種型單一且遺傳同源性較高，MLVA-16和BruMLSA21的大部分位點在我國分離菌株中沒有多態性或者僅呈現有限的多態性[2,8]，對菌株區分能力較弱，無法滿足布病流調中對病原追溯的需求。因而，有必要建立一個分辨率高的、適合我國布魯氏菌遺傳特性的分型方法，為我國布病分子流行病學調查和分析菌株間遺傳關系提供支持。

1 材料與方法

1.1 VNTR位點選擇和引物設計 根據已有文獻[3,9]，對95個已知布魯氏菌VNTR位點進行重新篩選和評價。VNTR篩選依據包括：(1)所有位點在牛種、羊種和豬種布魯氏菌參考菌株(B.melitensis16M,B.abortus2308和B.suis1330)中都存在；(2)在同一PCR反應條件下，所有VNTR位點都能有效擴增；(3)VNTR位點在布魯氏菌基因組中均勻分布；(4)為了方便檢測，擴增片短長度在100～ 600 bp 之間，特異性高，無其他非特異性帶。布魯氏菌參考菌株的基因組由中國動物衛生與流行病學中心提供；PCR有關試劑購自寶生物工程有限公司(Takara)。

1.2 與傳統的MLVA-16分型方法的比較 利用我國分離的51株羊種布魯氏菌分離菌株(中國動物衛生與流行病學中心人獸共患病監測室提供)對不同MLVA分型方法進行對比評價。這些菌株分別來自我國新疆、山東、甘肅、河南、河北五省的不同地市，分離時間為2010-2016年，具有一定的代表性，分離方法見文獻[6]。通過PCR和毛細管電泳方法來確定各菌株每個VNTR位點擴增產物的分子量，根據分子量大小計算VNTR位點的重復單元數。用Hunter-Gaston Diversity(HGDI)指數對每個VNTR位點的多態性進行分析(http://www.hpa-bioinformatics.org.uk/cgi-bin/DICI/DICI.pl)。應用BioNumerics 7.6軟件對菌株之間的親緣關系進行聚類分析。細菌基因組提取試劑盒由寶生物工程有限公司(Takara)提供。

1.3 與BruMLSA21分型的比較 利用上述51株羊種布魯氏菌分離菌株，參照Sun M J方法[8]對21個基因位點進行PCR擴增和測序。測序結果與BrucellaMLST數據庫進行比對(https://pubmlst.org/Brucella/)，對出現的新等位基因給定一個獨特的數值，在21個基因位點上只要有一個新的等位基因則定義為一個新的序列型。21個位點的序列組裝連接后，利用MEGA 5.1軟件繪制系統進化樹。

2 結果與分析

2.1 MLVA分型方法的優化 通過對布魯氏菌VNTR位點進行篩選和評價，其中47個VNTR位點符合要求，刪除多態性位點相近的位點，最終選擇了15個VNTR位點(I號染色體10個，Ⅱ號染色體5個)，作為一個新的MLVA分型方法-MLVA-15，各VNTR位點的引物、重復片段長度、PCR產物大小與重復片段拷貝數等信息見表1。與傳統的MLVA-16分型方法相比，MLVA-15分型方法保留了其中8個VNTR位點(Bruce04、Bruce09、Bruce16、Bruce30、Bruce42、Bruce43、Bruce45 和Bruce55)，另外又包括了7個未被使用的位點(Bruce13、Bruce15、Bruce17、Bruce24、Bruce72、BruceVNTR1和BruceVNTR25)。PCR反應條件如下：95 ℃ 5 min預變性；然后進行30個循環的擴增(95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min)，最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。

表1 MLVA-15 VNTR位點信息表Tab 1 Information of VNTRs in MLVA-15

2.2 MLVA-15與MLVA-16分型方法的比較 對51株我國羊種布魯氏菌分離菌株MLVA-15 VNTR位點的多態性分析結果顯示，除了Bruce45和Bruce55 2個VNTR位點，其他所有位點均呈現不同程度的多態性(HGDI=0.077～0.887)(表2)。其中，Bruce04、Bruce24、Bruce30和BruceVNTR1 4個位點的多態性最高(HGDI=0.718～0.887)，其余9個位點具有中等或較低的多態性(HGDI=0.077～0.645)。MLVA-15分型方法對菌株的區分能力明顯提高，51株布魯氏菌分為51個基因型，對菌株的鑒別效率達到100%(圖1)。MLVA-16分型方法僅鑒定出28個基因型，對菌株的區分效率為55%，顯著低于MLVA-15(圖2)。對于菌株之間的遺傳關系分析，MLVA-15分型方法與MLVA-16分型方法獲得的聚類結果基本一致，具有相同MLVA-16基因型的5個菌株(Bruxj20、Bruxj35、Bruxj99、GS1683和GS1692)在MLVA-15聚類圖上也聚為一簇(圖1、圖2)，表明MLVA-15分型方法不會對以往MLVA-16分析遺傳關系的結果產生較大的改變。

表2 MLVA-15各VNTR位點在51株布魯氏菌中的多態性Tab 2 Genetic diversity of MLVA-15 VNTRs in 51 B. melitensis isolates

2.3 MLVA-15與BruMLSA21分型方法的比較 對21個基因的測序結果表明，51株羊種布魯氏菌菌株共發現4個序列型(Sequence type, ST)，分別為ST8、ST137、ST138和ST139。其中37株屬于ST8，ST139菌株也比較常見(12株)，ST138和ST137僅有1株。4個序列型之間的差異很小，是由三個基因的單核苷酸突變引起的，表明我國羊種布魯氏菌流行株在遺傳上是十分保守的(表3)。

表3 51株羊種布魯氏菌流行株序列型分析Tab 3 ST designation of 51 B.melitensis strains

3 討論與小結

以MLVA和MLSA為主的分子分型方法在分析布魯氏菌變異程度和遺傳關系上起到重要作用。MLVA利用布魯氏菌基因組中的VNTR位點來研究布魯氏菌遺傳多態性，因為不同拷貝數的重復序列經常出現在不同種或同一個種的不同株、型之間。其中，MLVA-16分型方法最為常用[10-11]。該法包括16個VNTR位點，分為Panel 1和Panel 2兩組。Panel1的8個位點的多態性較低，僅用于遺傳關系較遠的菌株的鑒別，尤其是布魯氏菌在種水平上的鑒別。Panel2的8個位點具有中等或較高的遺傳多態性，適用于遺傳關系較近的同種(或生物型)菌株的鑒別[4,9]。這種VNTR位點組合可以分析流行菌株之間的差異和遺傳關系，但對國內當前布魯氏菌流行菌株的鑒別能力略顯不足。對于國內羊種布魯氏菌，16個VNTR位點僅有3個位點(Bruce04、Bruce16、Bruce30)具有較高多態性，1個位點(Bruce43)具有中等多態性，其余12個位點的多態性很低或沒有任何多態性。研究建立的MLVA-15方法減少了MLVA-16中8個不具有多態性的位點，增加了7個多態性較高的位點，提高了對布魯氏菌流行菌株的鑒別能力，可以滿足布病流行病學調查中對傳染源和傳播途徑精確追溯的需求。

右側數據依次為菌株分離地點、名稱、生物型和分離時間Right columns represents isolation location, names, biotype and isolation date圖1 51株我國羊種布魯氏菌MLVA-15聚類分析結果Fig 1 MLVA-15 cluster analysis on 51 B.melitenis isolates

右側數據依次為菌株分離地點、名稱、生物型和分離時間Right columns represents isolation location, names, biotype and isolation date圖2 51株我國羊種布魯氏菌MLVA-16聚類分析結果Fig 2 MLVA-16 cluster analysis on 51 B.melitenis isolates

BruMLSA21分型是利用布魯氏菌21個看家基因的單核苷酸多態性來區分菌株的方法，核苷酸序列變異也可反映菌株之間的進化關系。BruMLSA21分析表明，我國大部分羊種布魯氏菌流行株屬于ST8，同時還存在一些不常見的序列型。BruMLSA21與BruMLSA9相比(僅發現一個基因型ST8)[7]，對菌株區別能力大有提高，但與傳統的MLVA-16和新建立的MLVA-15分型方法相比，對菌株的分辨能力還是很低。盡管增加基因個數或長度可以增加其分辨力，但同時也增加了測序成本，不適合推廣使用。因為有全球化的數據庫(https://pubmlst.org/)，便于各國分離菌株之間的比較，BruMLSA21在分析各國布魯氏菌菌株的遺傳多態性以及進化分析方面仍具有參考意義[8,12]。

除了MLVA和BruMLSA21，基于全基因組測序的SNP分型方法(WGS-SNPs based typing)對布魯氏菌菌株具有極高的辨別能力，也開始用于我國布魯氏菌流行菌株的遺傳多態性和進化關系分析[13]，但是由于檢測成本較高，該方法目前使用較少。因而在未來的一段時期，基于不同VNTR位點組合的MLVA分型技術仍將在布魯氏菌的分離鑒定及遺傳關系分析方面發揮重要作用。