北京地區銷售的10種中藥飲片微生物污染程度考察

張光華 王似錦 江志杰 高春

摘 要 目的：考察北京地區10種中藥飲片微生物污染程度。方法：采用微生物限度檢查法檢查10 種共100 批中藥飲片樣品的需氧菌總數（TAMC）、霉菌和酵母菌總數（TYMC）、耐熱菌數（NAIRE）、耐膽鹽革蘭氏陰性菌及其他6種致病控制菌負載量。結果：100批飲片樣品的lgTAMC值為2.0～6.8，lgTYMC值為1.0～6.0，lgNAIRE值為1.0～5.9，耐熱菌檢出率為100%，耐膽鹽革蘭氏陰性菌檢出率為27%，2批當歸飲片樣品中檢出了大腸埃希菌，但所有飲片樣品均未檢出沙門菌、志賀氏菌、溶血性鏈球菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌。結論：北京地區銷售的不同品種的中藥飲片的微生物負載差別很大，建議新版藥典根據中藥飲片的入藥部位、藥性、炮制工藝等制訂適宜的微生物限度標準。

關鍵詞 中藥飲片；需氧菌；霉菌；酵母菌；耐熱菌；控制菌；限度標準

中圖分類號 R921 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）14-1940-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.14.16

ABSTRACT OBJECTIVE： To investigate the microbial contamination of the different medicinal parts of 10 kinds of TCM decoction pieces in Beijing. METHODS： By microbial limit test stated， total aerobic microbial count （TAMC）， total yeasts and molds count （TYMC）， heat-resistant strains count and bile-tolerant Gram-negative bacteria count of 100 batches of 10 kinds of TCM decoction pieces were determined， and loading amount of 6 kinds of pathogenic bacteria were also tested. RESULTS： lgTAMC of sample ranged 2-7， and lgTYMC ranged 1-6； the detection rate for heat-resistant strain was 100%； the detection rate for bile-tolerant Gram-negative bacteria was 27%； Escherichia coli was found in 2 batches of Angelica sinensis； Salmonella shigella， Hemolytic streptococcus， Hemolytic streptococcus， Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa was not found in all TCM decoction pieces. CONCLUSIONS： The microbial load of different types of TCM decoction piece were greatly different in Beijing area. It is suggested to formulate suitable microbial limit standard in new edition of pharmacopoeia according to medicinal part， drug property， processing technology.

KEYWORDS TCM decoction piece； Aerobic microorganism； Molds； Yeasts； Heat-resistant strain； Control bacteria； Limits

中藥飲片是中藥材按中醫藥理論，經加工炮制后可直接用于中醫臨床或制劑生產的處方藥品。由于中藥飲片多源于天然植物（如根、莖、葉、花、果實）、動物（如臟器）和礦物，其本身可能帶有大量的細菌、真菌等微生物。另外，中藥材在采集、貯藏和運輸過程中也可能受到各種微生物的污染，如果保存不當，還可能造成微生物大量滋生。而按傳統的中藥飲片加工炮制方式往往不能完全去除污染的微生物，給中藥飲片及中成藥的使用帶來潛在的風險[1-5]。雖然大部分中藥飲片在服用之前需要進行煎煮，但傳統的煎煮方式不能徹底去除微生物。

現行的2015年版《中國藥典》尚未制訂中藥飲片的微生物限度標準。而《歐洲藥典》[6]、《美國藥典》[7]和《日本藥典》[8]對植物藥或天然藥均有關于微生物限度的規定，這符合從源頭控制藥品質量的理念。由于國內對中藥飲片的微生物污染狀況長期缺乏監控，導致中藥飲片的衛生質量方法缺乏全面的評價標準。而要制訂合理的中藥飲片微生物限度標準需建立在大量的試驗數據基礎之上。因此，本課題組采用2015年版《中國藥典》（四部）微生物限度檢查法考察了北京地區銷售的10種共100批中藥飲片的微生物污染程度，為中藥飲片微生物標準的制訂提供參考。

1 材料

1.1 儀器

DL-CJ-2ND 型層流潔凈工作臺（北京東聯哈爾儀器制造有限公司）；HFsafe-1500型生物安全柜（上海力申科學儀器有限公司）；SPX-250B-Z型生化培養箱（上海博迅實業有限公司醫療設備廠）；VITEK2-Compact型全自動細菌鑒定系統[生物梅里埃（中國）有限公司]；BX61型生物顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2 試劑

pH 7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液、胰酪大豆胨液體培養基（TSB）、胰酪大豆胨瓊脂培養基（TSA）、沙氏葡萄糖瓊脂培養基（SDA）；志賀氏菌檢測、溶血性鏈球菌檢測用培養基及平板、紫紅膽鹽瓊脂平板均為本課題組自制；氯霉素（北京陸橋技術股份有限公司）。

1.3 中藥飲片

2015年10月，筆者從北京地區12個飲片廠購買共10種100批中藥飲片，詳見表1。

2 方法

2.1 參考標準

其他各國藥典與中藥飲片相當的植物藥或天然藥的微生物限度值見表2（表中TAMC為需氧菌總數，TYMC為霉菌和酵母菌總數）。

2.2 供試品溶液的制備

取飲片樣品25 g，加入pH 7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液225 mL，振搖蕩洗約10 min，取其上清液，即得供試品溶液（1 ∶ 10，V/V）。

2.3 TAMC、TYMC的檢查

取“2.2”項下供試品溶液適量，以pH 7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液分別稀釋至1 ∶ 100、1 ∶ 1 000、1 ∶ 10 000、1 ∶ 100 000（V/V），按照2015年版《中國藥典》（四部）通則1105“微生物計數法”[9]檢查TAMC（TSA，1 mL/皿）、TYMC（SDA，1 mL/皿，氯霉素終質量濃度為0.1 g/L），結果以常用對數形式表示。

2.4 耐熱菌數（NAIRE）的檢查

取“2.2”項下供試品溶液適量，以沸水?。?00 ℃）熱處理30 min，按“2.3”項下TAMC檢查方法檢查NAIRE。

2.5 控制菌的檢查

2.5.1 耐膽鹽革蘭氏陰性菌 取“2.2”項下供試品溶液10 mL，按照2015年版《中國藥典》（四部）通則1105“微生物計數法”[9]進行耐膽鹽革蘭氏陰性菌的定性、定量檢查。設計1×10-1、1×10-2、1×10-3、1×10-4、1×10-5 5個質量級別。

2.5.2 沙門菌 取飲片樣品10 g，按照2015年版《中國藥典》（四部）通則1105“微生物計數法”[9]檢查沙門菌。

2.5.3 大腸埃希菌 取“2.2”項下供試品溶液10 mL，按照2015年版《中國藥典》（四部）通則1105“微生物計數法”[9]檢查大腸埃希菌。

2.5.4 志賀氏菌 取飲片樣品25 g，接種至225 mL志賀氏菌增菌肉湯中，于41.5 ℃厭氧環境下培養18 h，取適量培養菌液分別劃線于XLD瓊脂平板和志賀氏菌顯色培養基平板上，于36 ℃下培養24 h，按照國家標準[10]方法檢查志賀氏菌。

2.5.5 金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌 取“2.2”項下供試品溶液10 mL，按照2015年版《中國藥典》（四部）通則1105“微生物計數法”[9]檢查金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌。

2.5.6 溶血性鏈球菌 取飲片樣品25 g，接種至225 mL改良胰蛋白胨大豆肉湯培養基（mTSB）中，置于36 ℃下培養24 h，取適量培養液劃線接種于哥倫比亞CNA血瓊脂平板上，于36 ℃下培養24 h，按照國家標準[11]方法檢查溶血性鏈球菌。

本試驗對10種共100批飲片樣品均按照2015年版《中國藥典》（四部）通則1105“微生物計數法”[9]進行了計數培養基適用性試驗和計數方法適用性試驗。結果表明，本方法適用性良好。

2.6 統計學方法

采用SPSS 13.0軟件對數據進行統計和分析。計數資料采用描述性分析方法。

3 結果

3.1 飲片樣品的TAMC檢查結果

飲片樣品的TAMC檢查結果見表3。對lgTAMC結果進行描述性分析，結果見表4；以100 批飲片樣品的lgTAMC值為橫坐標、lgTAMC頻數為縱坐標作直方圖和分布曲線，結果見圖1；以飲片品種為橫坐標、lgTAMC值為縱坐標作箱式圖，結果見圖2。由表4可知，100 批飲片樣品的lgTAMC值總體均數為4.1，其95%置信區間為3.9～4.4，中位數為3.8，低于5.0，表明飲片樣品的TAMC平均水平符合歐洲、美國、日本藥典標準；lgTAMC極大值為6.8，說明100 批飲片樣品的lgTAMC值均小于7.0，表明飲片樣品的TAMC整體水平符合歐洲、日本藥典標準。由圖1可知，100批飲片樣品中，80%的lgTAMC值小于5.0，符合歐洲、美國、日本藥典的標準。由表3、圖2可知，丁香飲片樣品（S7）的lgTAMC值為2.6～3.6，兒茶飲片樣品（S8）的lgTAMC值為2.4～4.4，表明其污染的TAMC較低，且各批間差異小，質量穩定；白芍飲片樣品（S6）的lgTAMC值為2.0～6.2，表明其污染的TAMC各批間差異最大，質量最不穩定；炒白術、熟地黃飲片樣品（S4、S2）的lgTAMC值較白術、地黃飲片樣品（S3、S1）明顯低，表明加熱炮制工藝可以降低TAMC負載；松花粉樣品（S10）的lgTAMC值為5.8～6.8，在所有品種中最高，同時也遠高于所有品種的平均水平，表明其TAMC負載相當高，不符合美國藥典標準。

3.2 飲片樣品的TYMC檢查結果

飲片樣品的TYMC檢查結果見表3。以100 批飲片樣品的lgTYMC值為橫坐標、lgTYMC頻數為縱坐標作直方圖和分布曲線，結果見圖3；以飲片品種為橫坐標、lgTYMC值為縱坐標作箱式圖，結果見圖4。由圖3可知，100批飲片樣品的lgTYMC值呈偏態分布，其中超過40%的lgTYMC值為1.0～1.5，超過70%的lgTYMC值小于3.0，超過80%的lgTYMC值小于4.0， 約90%的lgTYMC值小于5.0，表明90%的飲片樣品污染的TYMC符合歐洲藥典標準，80%符合日本藥典標準，70%符合美國藥典標準。由表3、圖4可知，10 種飲片樣品中除兒茶、松花粉飲片樣品（S8、S10）外，有8個品種lgTYMC值的均數和中位數均不超過3，表明這8種飲片樣品的TYMC負載相對較低；丁香、土荊皮飲片樣品（S7、S9）的lgTYMC值為1.0～1.5，表明其污染的TYMC較低，各批間差異小，質量穩定；白芍飲片樣品（S6）的lgTYMC值為1.0～5.7，表明其污染的TYMC各批間差異最大，質量最不穩定；炒白術、熟地黃飲片樣品（S4、S2）的lgTYMC值較白術、地黃飲片樣品（S3、S1）明顯低，表明加熱炮制工藝可以降低TYMC負載；松花粉飲片樣品（S10）的lgTYMC值中位數最大，為5.8，遠高于所有品種的平均水平，表明其TYMC負載高，僅有1批松花粉飲片的lgTYMC值為2.5，即按照歐洲、美國、日本藥典標準僅有1批的TYMC符合規定。

3.3 飲片樣品的NAIRE檢查結果

飲片樣品的NAIRE檢查結果見表3。以100 批飲片樣品的lgNAIRE值為橫坐標、lgNAIRE頻數為縱坐標作直方圖和分布曲線，結果見圖5；以飲片樣品品種為橫坐標、lgNAIRE值為縱坐標作箱式圖，結果見圖6。由圖5、圖6可知，100 批飲片樣品經過100 ℃、30 min熱處理后，全部仍有需氧菌檢出，但是較未熱處理時的需氧菌負載有了明顯的降低（對比圖1）。熱處理后，100批飲片樣品中，45%以上的lgNAIRE值降到2.0以下，僅有約10%樣品的lgNAIRE值大于5.0，與未熱處理的lgTAMC值相比明顯減小。100 ℃、30 min熱處理后lgTAMC下降值、下降百分比見圖7、圖8。由圖7、圖8可知，100批飲片樣品經過熱處理后，大部分的lgTAMC值下降了1.0～2.5，相當于原lgTAMC值的30%～60%。熟地黃飲片樣品（S2）lgTAMC下降值和下降百分比最大，分別為3.5、75.6%。松花粉飲片樣品（S10）的lgTAMC值下降的百分比最低，僅有17.4%。這提示不能因為中藥飲片在服用之前需要進行煎煮而忽略其微生物污染[12]。本試驗對污染嚴重的飲片樣品的耐熱菌進行分離鑒定，發現主要為芽孢桿菌屬的地衣芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、索諾拉沙漠芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、甲基營養型芽孢桿菌。芽孢桿菌類耐熱性極強，不易被殺滅。而現行各國藥典的微生物限度標準中均未規定耐熱菌的檢查，但由于中藥飲片多數情況下僅通過簡單的煎煮或開水沖泡后就服用，無法徹底殺滅耐熱菌，因此中藥飲片中耐熱菌的污染問題應引起足夠重視。

3.4 飲片樣品的控制菌檢查結果

2015年版《中國藥典》（四部）通則1107“微生物限度標準”[9]中對中藥提取物的控制菌有規定：不得檢出沙門菌（10 g）；耐膽鹽革蘭氏陰性菌應小于1×104 cfu/g。

3.4.1 耐膽鹽革蘭氏陰性菌 除松花粉飲片外的90批樣品中有27%的耐膽鹽革蘭氏陰性菌數（N）>10；10 批松花粉飲片樣品由于微生物負載量太高，影響檢出，未能得到結果。

將N值進行轉化，N<10轉化為0.5，10耐膽鹽革蘭氏陰性菌檢查中紫紅膽鹽瓊脂平板上分離鑒定的污染菌主要是阪崎腸桿菌、陰溝腸桿菌、路德維希腸桿菌、肺炎克雷伯菌以及歐文氏菌，均為條件致病菌。

3.4.2 沙門菌、大腸埃希菌、志賀氏菌、溶血性鏈球菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌 100批飲片樣品均未檢出沙門菌、志賀氏菌、溶血性鏈球菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌。僅2批當歸飲片樣品（S5）中檢出了大腸埃希菌。

4 討論

本研究對北京地區銷售的 10 種中藥飲片進行了微生物污染程度考察，建立了上述中藥飲片的微生物負載數據庫。2015年版《中國藥典》（一部）收載的藥材品種共618種（飲片規格823個），遠遠多于歐洲和日本藥典收載的天然藥物品種（美國植物藥僅作為營養和膳食補充劑），我國作為中藥材大國，更加需要制訂適合我國的中藥飲片微生物限度標準。

中藥飲片來源有植物藥、動物藥、礦物藥，就植物藥而言，由于入藥部位、炮制工藝和藥物特性不同，其微生物負載情況差別很大。在規范的加工、運輸、儲存條件下，通常全草類、根莖葉類、葉類、花粉類中藥飲片微生物負載較高，根莖類、皮類、莖類、種子類、果實類、塊根類中藥飲片微生物負載相對較低[13]。中藥飲片藥性中有抑菌作用的微生物負載較低[13]，涉及加熱炮制工藝的中藥飲片微生物負載相對較低[14]。正在進行的2020年版《中國藥典》編制工作，將進一步完善中藥質控項目，重點加強中藥飲片質量標準研究與制定，以全面提升中藥的安全性和有效性?；诒狙芯拷Y果，建議新版藥典根據中藥飲片的入藥部位、藥性、炮制工藝等制訂適宜的微生物限度標準，引導中藥飲片企業合理加工炮制、規范生產和科學儲運。

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（收稿日期：2017-12-20 修回日期：2018-03-14）

（編輯：張 靜）