作物保護中用RNA干擾技術防治節肢動物害蟲、病原菌和線蟲

葉 萱 編譯

(上海市農藥研究所，上海 200032)

1 發現和引入

在秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans)中發現RNA沉默機制后，此技術就廣為人知，但首次報道植物中的此現象是在1928年。在此報道中，Wingard介紹了煙草感染煙草環斑病毒后的癥狀情況，只有較低位置的葉片壞死了，上面的葉片對病毒有免疫作用而無癥狀。在當時還不知RNA沉默機制，但此例說明植物具有防御病毒作用，這可能是原始真核生物的最初功能之一。后來，在另一重要文章中，Napoli和其同事報道矮牽牛植物中查爾酮合酶的過度表達使植物開的花為雜色，而不是預期的深紫色。那時此現象被稱為“翻譯后基因沉默(post-translational gene silencing)”，現在被認為是RNA干擾(RNAi)研究的早期成功事例之一。在其他包括真菌的數個真核生物中也發現了相似的現象，被稱為“抑制(quelling)”。Fire和Mello對秀麗隱桿線蟲的研究發現了以上所有的現象，稱為“RNA干擾”。此被認為是近 20年中最重要的科學突破之一，由于 Fire和Mello發現了真核生物的RNAi機制，在2006年他們共同被授予諾貝爾生理學或醫學獎。此發現最后導致生物學研究中新學科的誕生，即研究非編碼RNA(ncRNA)，也就是沒有被轉化為蛋白質的RNA分子。此機制的闡明對了解基因調控、基因功能和抗病毒防御作用有極大的作用。

從害物防治的觀點看，ncRNA引發了RNAi機制，導致基因沉默，通過破壞相應的信使 RNA(mRNA)阻礙重要靶標基因的表達。與傳統神經毒性殺蟲劑等害物防治策略相比，RNAi技術具有高度的特異性，可用于基因研究和農業，如保護有益昆蟲免受病毒和寄生物危害，抗性管理和防治許多作物免受害蟲、植物病原菌、螨、蜱蟲危害等(圖1)。

RNAi技術產品能提供新的補充的害物防治解決方法，其效果和選擇性遠高于化學農藥等傳統方法。預期基于RNAi的生物農藥以轉化產品(整合于植物的保護劑，PIPs)和非轉化產品/非 PIP產品(噴霧、莖稈注射、灌根、種子處理或粉劑/顆粒產品)上市。市場對雙鏈RNAs (dsRNAs)不斷增長的興趣已促使開發出更好的生產系統，更有效的制劑，成本也從2008年的每克12 500美元下降到現在約2美元(2017年9月)。雖然仍缺乏田間試驗，但預測dsRNA的使用量約為2～10 g/hm2。此用量可能因靶標害物對RNAi的敏感性，對RNAi的內吸性和制劑的傳遞性不同而變化。此產品對作物的保護和對環境的風險應處于平衡，考慮到 RNAi具有獨特作用機制，可能也沉默未預期的基因，故使用一定方法全面評估基于RNAi的農藥和工程化作物的潛在風險。

應用農業生物技術已開發了一些 RNAi產品。本文旨在為新穎保護作物RNAi產品開發機會，討論了它們防治植物病原菌、線蟲、螨、植物病害和影響有益昆蟲的病原菌的潛力。此外，討論了RNAi技術的環境影響和經濟成本，也提出轉化基礎RNAi研究為新穎實際應用的方式。

2 何為RNAi以及如何起作用

RNAi是大多數真核細胞中通過mRNA降解、抑制翻譯和染色質重塑來調節基因表達的古老機制。其啟動子為具有2個補充鏈的 RNA分子，即dsRNA，屬于ncRNAs類型(圖1)。約21-25 bp dsRNA分子具有約2-nt 3′突出端(overhang)，能夠被RNAi機器的酶識別，隨后靶標mRNA進行同源依賴性降解。在RNAi途徑中有2個重要類別RNA：microRNA(miRNA)和小干擾 RNA (siRNA)。除了這些典型miRNA和 siRNA，持續發現其他類別的 RNA，表明這些RNA參與的途徑和調控機制的多樣性。本文將集中介紹miRNAs和siRNA。

圖1 作為一系列保護作物，改善作物，改良蜜蜂健康和抗性抑制的工具的RNA干擾(RNAi)技術

miRNA主要為生物內生，在細胞中由莖環前體和不完全雙鏈配對產生。相反，siRNA為外源物，從病毒、轉座子或轉基因衍生而來的長而完全互補的dsRNA生成。為了簡單闡述siRNA和miRNA的分子機制，它們最初都由 dsRNA經核糖核酸Ⅲ酶Dicer加工為20-30-nt雙鏈而產生。之后，有催化作用的Argonaute家族蛋白(AGO)被納入RNA誘導的沉默復合體(RISC)中。RISC既介導 mRNA的降解又抑制翻譯。在大多數真核生物中，除昆蟲和脊椎動物外，主要dsRNA啟動子通過RNA依賴性RNA聚合酶(RdRP)的作用誘導次級siRNA的合成，此現象為過渡性 RNAi(transitive RNAi)。這些次級siRNAs以不是最初dsRNA分子的靶標的mRNA區域為靶標，潛在地沉默多個轉錄。在昆蟲和脊椎動物，還沒有發現相似的基于 RdRP的擴增系統，因此過渡性 RNAi的缺乏可能增加特異性，而以單個替代性剪接mRNA同源體為靶標。這3類分子，即Dicer、Argonaute和RNA的20-30-nt雙鏈，被稱為基因RNA沉默的必要要素，已有文章進行詳盡介紹。

重要的是，RNAi有2個相關方面因生物種類不同變化很大。第一為沉默效應的持效期，第二為系統性RNAi性能。由dsRNA擴增產生的次級siRNA能夠產生長時間強而持續的反應。此外，RNAi的系統特性也就是RNAi信號/作用在細胞間和組織間的擴展，能夠導致 RNAi效應的可遺傳性傳遞(親本RNAi，parental RNAi)。當dsRNA到達生殖細胞，沉默信號傳遞到下一代的胚胎就會發生親本RNAi。

根據生物的需要可在任何時候啟動miRNA和siRNA沉默。因此，內源基因的表達方式的變化與生物所處的環境有關，受新miRNAs表達的調控。相似地，當基因組面臨入侵者(例如病毒)核酸的威脅時，就以siRNA機制降解這些核酸，以免受威脅。

RNAi能特異性抑制任何基因的表達。因為21-25-bp dsRNA可被設計為獨特的，只能沉默既定靶標基因。因此，其在農業中有廣泛的應用，可保護蜜蜂免受病毒和寄生物的危害，可作為新穎的高度特異性的害物防治策略。

3 RNAi用于害物管理

自從發現RNAi以及其調節潛力后，它為害物防治打開了一扇新的大門?？茖W家已利用RNAi關閉基因，開發出與已有所有商業化產品不同的具有獨特作用機制的產品。

此愿景方法的目的是開發 RNAi機制來獲得一系列害物防治的工具，以及以重要基因為靶標，利用此機制抑制農藥抗性的發展(圖 1)。例如，“BioDirect”產品利用 RNAi進行害蟲和病毒的防治，對蜜蜂的安全性高，和化學除草劑合并對雜草的防效高。這些項目目前還處于于研究和開發的第一和第二階段。

田間應用RNAi可能包括傳統的PIPs (即轉基因植物/基于RNAi植物形狀)，以dsRNA為活性成分，應用可變的傳遞方式的殺蟲劑、殺菌劑、殺螨劑和抗病毒制劑產品(第4節)。此外，這些dsRNA能被用于抑制昆蟲和雜草的抗性產生。對于此第二類別的非PIPs，含dsRNA的終端產品(dsRNA-EPs)可能以4種類別上市：⑴ 防治劑；⑵ 抗性因子抑制劑；⑶ 發育干擾劑；⑷ 生長促進劑。本文中僅討論與作物保護有關產品的發展。

筆者認為開發高度量身定做的保護作物和促進作物發育的 RNAi產品的潛力部分由靶標生物高度變化的響應性決定。因此，以下討論誘導昆蟲、真菌、其他植物病原菌、線蟲和螨中RNAi和使用RNAi產品為抗性因子抑制劑進行昆蟲和雜草的管理的例子，這可被進一步開發用于農業產品。

3.1 節肢動物

RNAi對一些昆蟲特別有效，特別是鞘翅目昆蟲，作用快?？上У氖趋[翅目和半翅目害蟲對外部RNAi的對抗性很強，表明具有生物屏障限制RNAi用于管理這些昆蟲。闡明這些瓶頸可能使具有獨特性和新穎作用機制的此技術用于綜合害物管理(IPM)策略。

Baum等人撰寫的里程碑性文章表明在轉基因玉米中的dsRNA能導致玉米根蟲(WCR, Diabrotica virgifera)幼蟲死亡。此研究使研究人員意識到daRNA具有通過轉基因作物作為新的害物防治劑的潛力。在2016年9月，加拿大食品檢驗局批準新玉米品種MON87411的商業化，其商品名為SmartStax PRO，表達了3個Crystal (Cry)基因和含有玉米根蟲蔗糖非發酵7(DvSnf7)基因的240-bp片段的dsRNA。在2017年6月，美國環保局也批準此玉米商業化種植。DvSnf7基因編碼液泡分選中的重要蛋白，到目前為止還沒有開發出干擾這個過程的殺蟲劑。然而，由于RNAi機制，Snf7 dsRNA單獨需要很長時間來有效殺死玉米根蟲。因此，MON87411合并了來自Bt (Bacillus thuringiensis)以主要鱗翅目害蟲和WCR為靶標的作用更快的 Cry 基因以及葉甲(Diabrotica spp.)復合體。這些機制(即 Bt和 RNAi)聯合的主要目標是降低昆蟲對Bt技術抗性的產生。已研究表明轉基因玉米中 Snf7 dsRNA的表達能夠保護玉米根免受WCR幼蟲的危害。

完全不同的應用路線是使用可噴霧dsRNA，考慮到dsRNA在環境中預期的半衰期短，與化學農藥相比是環境友好替代法。葉用的dsRNA分子在溫室條件下至少穩定 28 d可防治馬鈴薯甲蟲(Leptinotarsa decemlineata)，一旦在葉子上干燥了，dsRNA就不可浸出。已開發在柑橘葉上噴霧使用dsRNA防治柑橘象鼻蟲(Diaprepes abbreviates)的RNAi策略，此方法具有防治這些叮咬/咀嚼害蟲的前景。噴霧 dsRNA的效果令人鼓舞，但有幾個方面還需要改進，預期含有dsRNA的終端產品在2019年上市。

噴霧 dsRNA可能防治取食植物的咀嚼害蟲非常有效，但對半翅目等刺吸式害蟲不是理想的方法。對于此類害蟲，開發了植物系統(in plant system，iPS)方法，即用植物新芽(vegetative new growth flushes)傳遞dsRNA來防治柑橘木虱(Diaphorina citri)。使用此方法，當給柑橘木虱飼喂以精胺酸激酶為靶標的 dsRNA(即以對無脊椎動物的細胞能量和代謝有重要作用的基因為靶標)發生轉錄敲除和木虱死亡。

二斑葉螨(Tetranychus urticae)等螨是花卉植物和經濟作物的重要害蟲。由于大量使用農藥，二斑葉螨迅速對幾乎所有類型的殺螨劑產生了抗性。二斑葉螨基因組的獲得有助于了解其轉錄后基因沉默機制，這為使用RNAi防治螨鋪平了道路。以上描述的系統/親本RNAi被用于抑制Distal-less基因的表達，此基因是參與附肢形成的同源異形基因一員，例如肢體形態的形成。給成雌蟲注射 dsRNA或siRNA，就會產生縮短的和少腿的后代。建立了葉碟飼喂傳遞dsRNA的方法。用此方法沉默運輸生物合成膜的外被體蛋白亞基 β-2基因，導致二斑葉螨的死亡率最高(＞65%)。因此，此方法可被用于迅速篩選致死基因。柑橘全爪螨(Panonychus citri)是柑橘的重要害蟲，對大多數農藥有抗性，RNAi能有效防治此種害蟲。若蟲取食dsRNA處理的葉碟后Spook基因被沉默，56%若蟲死亡。這些結果表明以選擇基因為靶標的dsRNA被取食后能夠誘導基因敲除和螨死亡。因此這些靶標基因是開發為和Bt毒素和殺螨劑等其他防治策略聯用的螨防治策略的候選物。

當然，新防治策略引入后其害蟲抗性是人們常關注的問題。已知昆蟲具有很大的表型和遺傳可塑性，一些玉米根蟲個體對玉米 MON87411中的DvSnf7 dsRNA性狀較敏感或敏感性差。選用田間收集的對作物輪作有和無抗性的種群進行試驗，試驗表明昆蟲對攝取的dsRNA有不同的反應。這表明不同玉米根蟲種群對 RNAi農藥的表型反應不同，證實 RNAi具有抗性發展潛力。綜合害物管理原則可延緩抗性的產生。在美國環保局聯邦殺蟲劑、殺菌劑和殺鼠劑法案會議上討論的對轉基因 RNAi作物的可能抗性機制如下：⑴ dsRNA靶標序列240 bp被認為可發生變化，如DvSnf7 dsRNA，但較短的靶標也可能發生變化，單核苷酸多態性的出現可能降低dsRNA和其靶標的互補性。長的dsRNAs(＞200 nt)能夠導致較大量的siRNAs與靶標mRNA匹配，而可能具有優勢，能增加RNAi反應，阻止選擇基因變化的個體。⑵ 對吸收、運輸等重要的天然屏障引起的dsRNA動力學變化。⑶ siRNA分子的RIS復合體的識別的下降，RISC復合體降解靶標 mRNA的功能障礙，Dicer核糖核酸酶加工過程的減少或阻礙RNAi信號系統擴展等RNAi機器酶或成分的變化。⑷ 昆蟲可能發展不同的機制來補償特異基因沉默，如增加轉錄率或上調與沉默基因有相同或相似功能的其他基因。⑸ 在昆蟲取食轉基因植物期間，由于嗅覺或味覺變化導致對dsRNA吸收的減少，對食物中dsRNA產生抗性。然而，就以上參數而論，SmartStax PRO玉米與非轉基因品系沒有差異。在美國環保局聯邦殺蟲劑、殺菌劑、和殺鼠劑法案會議期間，一個報告表明用SmartStax PRO處理的盆栽作物中出現了約134個玉米根蟲成蟲，但沒有證據表明這些個體對dsRNA DvSnf7產生抗性。以上提及的許多機制可能都是潛在的抗性機制，但到目前為止都沒有被證實。采用傳統的避難所，就是留有一定面積的沒有以上性狀的作物或不施用農藥的作物，合用多個不同作用機制的殺蟲劑以及不同防治策略能延緩昆蟲對RNAi轉基因作物發展抗性。

3.2 真菌和其他植物病原菌

在大多數情況下，RNAi途徑和其主要成分，例如Dicer、Argonaute和RdRP，出現于大多數真菌品種中，這表明大多數真菌也是RNAi的靶標。RNAi也可被開發來干擾許多種類病毒的復制，所以RNAi途徑可用于防治病毒和真菌植物病害。

影響谷物作物的數種病害，例如鐮刀菌屬死體營養真菌引起的赤霉病(FHB)和苗立枯病(FSB)可用RNAi成功壓制。例如Kock等人用含有dsRNA的培養基離體培養禾谷鐮刀菌(Fusarium graminearum)，此 dsRNA與負責麥角甾醇生物合成的細胞色素P450基因CYP51A、CYP51B和CYP51C互補，結果為 dsRNA具有如唑類殺菌劑抑制病原菌生長和引起形態變化的作用。研究表明表達相同 dsRNA(CYP51)的轉基因植物擬南芥和大麥對禾谷鐮刀菌侵染有高的抗性。相似地，在dsRNA被應用的地區，以負責真菌麥角甾醇生物合成的 CYP3為靶標的dsRNA用于大麥葉面防治禾谷鐮刀菌的侵染。dsRNA首先到達木質部等質外體，然后以未知的機制轉移到共質體。

以前的工作表明引起植物灰霉病的真菌病原菌灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)的2個類Dicer(DCL1/2)核糖核酸內切酶被敲除后，其致病力基本喪失，生長停止。DCL1和DCL2參與小RNAs的生物合成，被認為是RNAi途徑的主要成分。在最近的工作中，用能使單獨 DNA結合在一起的重疊聚合酶鏈反應技術在轉基因擬南芥中成功表達Bc-DCL1/2片段。相似地，用煙草脆裂病毒(TRV)與 Bc-DCL1/2序列的重組載體，通過病毒誘導基因沉默(VIGS)，在番茄植物中表達Bc-DCL1/2-sRNAs。在2種情況下，Bc-DCL片段只啟動了灰葡萄孢菌中的RNAi機制，而不影響來自擬南芥或番茄植物的類 Dicer蛋白。這說明 RNAi由于具有序列特異性作用機制，對特定靶標有高的選擇性。Bc-DCL基因的沉默減弱了灰葡萄孢菌的致病性，其生長減緩了，而表達以馬鈴薯晚疫病抗性基因為靶標的sRNA的對照植物發病嚴重。最后，應用離體合成的作用于灰葡萄孢菌中相同基因的dsRNA或sRNA于水果、蔬菜和花表面也抑制灰霉病。這表明dsRNA可被用于防治獲后水果和蔬菜的病害。

菜豆金色花葉病毒(BGMV)被煙粉虱(Bemisia tabaci)傳播，菜豆被感染后產生金色花葉。開發的RNAi轉基因菜豆表達以可引起病毒侵染的AC1病毒基因為靶標的內含子發夾結構。具有高抗的轉基因植物品系，大約95%植物在高壓接種(每個植物有300多個帶病毒的煙粉虱)后不被侵染。

相似地，以外殼蛋白基因為靶標的 RNAi已被用于寄主誘導的基因沉默，使番木瓜樹和李樹分別對番木瓜環斑病毒和李痘病毒有抗性。這些是RNAi如何被用于防治植物病害和如何可能在栽培和獲后采用用于防治1個植物品種病害的RNAi防治其他作物的其他病害的例子。

3.3 線蟲

已有資料介紹 RNAi對模式線蟲秀麗隱桿線蟲有作用，dsRNA被注射或取食后也可傳遞給下一代(親本 RNAi)。

在農業中，根結線蟲給全球數種植物造成大的損失，包括使植物生長不佳，根癭形成，低的氮固定率，有時整個作物死亡。RNAi可被工程化對線蟲有抗性。例如，以前發現攝入以16D 10 dsRNA為靶標的dsRNA(以決定線蟲-寄主結合的基因為靶標)導致線蟲感染性下降。隨后，能產生以相同基因為靶標的dsRNA的轉基因擬南芥對4種根結線蟲[南方根結線蟲(Meloidogyne incognita)、爪哇根結線蟲(Meloidogyne javanica)、花生根結線蟲(Meloidogyne arenaria)和正北方根結線蟲(Meloidogyne hapla )]有抗性。這些結果表明與對照相比，16D 10 dsRNA轉基因品系每克根中根結線蟲卵的數量可減少93%。因此，此方法可被用于作物保護，開發轉基因作物為防治策略，使寄主對此重要病原菌有抗性。使用也以16D10基因為靶標的含有42 bp(pART27-42)或271 bp (pART27-271)的莖序列(stem sequence)的基于發卡的沉默結構，可開發出對線蟲有抗性的轉基因葡萄，此轉基因葡萄可導致南方根結線蟲侵染的減少。防治寄生性根結線蟲 RNAi也對其他根結線蟲屬靶標有效，如Phe-met-arg-phe(FMRF)類酰胺肽基因[編碼FMRF類肽(flp)-14和-flp-18，分別調節神經和肌肉活性]，但也對其他屬如短體線蟲屬和胞囊線蟲屬有效。所有這些例子說明工程化技術可使許多重要農業植物對多種根結線蟲具有抗性。

3.4 RNAi防治有益昆蟲的病害和寄生蟲

除了具有壓制重要害蟲和植物病原菌的潛力外，RNAi方法可用于防治蜜蜂和其他有益昆蟲的病毒病。RNAi的天然功能為保護細胞免受病毒感染，故此方法合乎邏輯。研究表明蜜蜂取食相對應于IAPV基因組的2個不同序列的dsRNA可免受以色列急性麻痹病毒(Israeli acute paralysis virus, IAPV)感染。故為了保護蜜蜂不被IAPV感染，dsRNA產品“Remebee”被用于大規模田間試驗。分別設置IAPV+Remebee、IAPV、Remebee和未處理對照，Remebee以飼喂進行處理。在不同的氣候和季節，在美國2個州(佛羅里達和賓夕法尼亞州)160個蜂箱進行試驗。結果為IAPV+Remebee處理蜜蜂的存活率增加了，蜜蜂的量和蜂蜜的量分別為 IAPA處理的2和3倍。相似地，給大黃蜂注射和飼喂病毒特異性dsRNAs，誘導IAPV特異性基因沉默和保護工蜂不被感染死亡。

RNAi也已被開發以狄氏瓦螨(Varroa destructor)等寄生蟲和東方蜜蜂微孢子蟲(Nosema Ceranae)等內微孢子蟲寄生蟲為靶標，防治蜜蜂成蟲廣泛發生的孢子蟲病，用于提高蜜蜂的健康水平。這些寄生蟲具有完全的RNAi作用機制，攝入dsRNAs后很容易被誘導產生RNAi。因此，把作用于東方蜜蜂微孢子蟲能量代謝基因(ADP/ATP轉運者)的dsRNA飼喂于被感染的蜜蜂，寄生蟲的負載量會減少。相似地，RNAi被用于防治以蜜蜂成蟲和幼蟲的血淋巴為食的專性寄生蟲狄氏瓦螨。當蜜蜂被飼喂作用于細胞骨架組裝、能量轉移和轉錄(例如 α-微管蛋白和RNA聚合酶 III)的數個狄氏瓦螨基因的特異性dsRNA混合物，螨的侵染可減少50%。有趣的是，以上處理對蜜蜂無明顯影響。由于養蜂者用有機磷等化學農藥防治狄氏瓦螨，螨已對許多化學產品產生抗性，RNAi方法雖然防效低于化學農藥但是是替代性防治策略。

3.5 壓制昆蟲和雜草抗性發展基因

隨著抗農藥的害蟲和雜草的數量在快速增加，開發壓制與除草劑和殺蟲劑抗性發展有關基因的dsRNA產品(抗性抑制劑，non-PIPs)的興趣也在不斷增加，此產品可被用于擴展現有化學農藥的壽命。以下將討論以 RNAi為抗性抑制劑，通過沉默害蟲和雜草的與抗性發展有關的基因，延緩抗性種群抗性的發展。

昆蟲主要有3種機制來應對毒物：行為、物理和生化機制。一旦毒物進入生物體，在毒物到達靶點前，生物會增加代謝解毒功能，滯留或排泄毒物。而 RNAi壓制與抗性發展有關基因的表達，能使害物恢復對特定毒物的敏感性。在1個研究中，RNAi被開發用于沉默P450酶(CYP6AE14)，此酶降低了棉鈴蟲(Helicoverpa armigera)對棉子酚的耐受性。棉子酚是植物產生保護自身免受害蟲危害的數個化合物之一。然而，CYP6AE14在棉鈴蟲幼蟲中腸中高度表達，棉鈴蟲就對有毒濃度的棉花代謝物棉子酚有耐受性。在棉鈴蟲中已確定 5個棉子酚誘導的CYP基因，這些基因使此害蟲對溴氰菊酯有耐受性。在東亞飛蝗(Locusta migratoria)體內，RNAi沉默溴氰菊酯誘導的CYP基因CYP408B1和CYP409A1，此害蟲再暴露于溴氰菊酯后死亡率增加(約 21%)，這表明這些基因與擬除蟲菊酯殺蟲劑的抗性有關。相似地，RNAi敲除了抗馬拉硫磷飛蝗體內2個高度表達的羧酸酯酶(LmCarE9和LmCarE25)后，此飛蝗暴露于馬拉硫磷的死亡率增加約34%。最近有文章綜述了如何應用RNAi研究害蟲的抗性以及管理抗性。

品牌技術“BioDirect”是利用合成的 cDNA，此cDNA與直接抑制雜草中5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)產生的RNA片段互補。對抗草甘膦雜草(例如通過EPSPS擴增而賦予抗性)，噴霧使用此產品和草甘膦后，草甘膦的效力恢復。

從作物保護觀點來說，RNAi通過抑制酶的正常產生，可能有助于應對代謝抗性，和化學殺蟲劑/除草劑合用，使殺蟲劑/除草劑的防效恢復。RNAi緩減代謝抗性的程度將取決于幾個因素：昆蟲/雜草品種和傳遞方法。例如，大多數鞘翅目害蟲對 RNAi非常敏感，因此dsRNA制劑可作為抗性抑制劑，而半翅目和鱗翅目昆蟲對其敏感性較差，其效果較低。此方法的效果也取決于沉默代謝途徑的主要基因和是否RNAi能有效沉默這些基因。沉默這些靶標基因并不總是可靠的，因為有些抗性并不是代謝所致且對大多數農藥來說其抗性機制未知。筆者認為單基因抗性用RNAi機制易于解決，而用RNAi較難減緩多基因抗性。

4 daRNA傳遞

到目前為止在作物保護領域中受到最大關注的傳遞方法為產生害物特異性dsRNA的轉基因作物。研究已表明轉基因傳遞能成功保護數種作物免受特異害蟲的危害。美國環保局最近登記了4個產品，這些產品含有名為“SmarStax PRO”的RNAI PIP，可用于防治WCR。SmartStax PRO中的基于RNAI的性狀導致含有 WCR Snf7基因的 240-bp片段的dsRNA轉錄。昆蟲取食MON87411后，此種植物中產生的dsRNA被WCR和與WCR密切相關的其他害蟲的RNAi機器特異性識別，導致Snf7基因下調，WCR死亡。然而，在許多情況下，由于政治或立法原因或被考慮的作物在技術上難以轉化為期望的，使用轉基因作物并不現實。因此，代替性dsRNA傳遞路線已被提出，這不涉及植物的轉化。

RNA可通過植物的微管系統移動。因此可葉用dsRNA或土壤應用根吸收來壓制害物的侵染。植物體內 dsRNA傳遞作為非轉基因傳遞方法已被報道能成功傳遞dsRNA到取食植物的靶標害蟲。葉面噴霧、根噴淋或莖桿注射dsRNA可使整個柑橘和葡萄樹受藥。2個半翅目昆蟲和1個取食木質部的葉蟬能通過取食用dsRNA處理的植物而吸收dsRNA。這表明植物根能吸收 dsRNA分子，莖桿注射后dsRNA通過植物的微管(木質部和韌皮部)傳遞。此發現為防治難防的取食根和刺吸式害蟲帶來了新的可能，特別對于植物轉化需數年以及費用高的多年生作物(例如葡萄和柑橘樹)。

特異性病原菌 dsRNA葉面用于植物進行害物抗性管理也可替代轉基因 RNAi。然而，僅 dsRNA噴霧于植物不穩定，是其實際應用的一大挑戰。最近研究表明把 dsRNA負載于專門設計的無毒可降解的層狀雙氫氧化物(LDH)納米黏土片(“生物黏土”)可保護dsRNA。一旦dsRNA負載于LDH上就不會被雨水沖掉，被持續釋放，即使在用后30 d在噴霧葉片上都能檢測到。此外，1次噴霧負載于LDH上的dsRNA，可保護被噴霧和新長出的未噴霧葉片不受病毒危害的時間至少為20 d。這證實dsRNA可以遷移到植物未處理的部分。然而，局部應用dsRNA對靶標基因轉錄只有暫時的修飾作用，不會改變基因組。這意味著由于陽光、微生物和細胞中天然dsRNA加工機制的降解，需要多次重復使用dsRNA。然而，此創新傳遞方法把傳遞 RNAi進行人類疾病治療的納米技術轉為用于作物保護的環保的可持續發展的易于應用的局部噴霧。

害物共生體能被工程化后傳遞 dsRNA到害物寄主。在共生體介導 RNAi中，共生體和其寄主間的關系被開發為持續產生dsRNA和誘導寄主中的RNAi。VIGS可被用于短暫沉默害蟲或寄主植物的病原菌靶標基因。在 VIGS中，害物特異性 RNAi誘導者序列被引入無致病性工程化病毒中，把工程化病毒暴露于害物細胞，對害物靶標基因mRNA特異性的siRNA將被沉默。當昆蟲或病原菌攝取被工程化病毒感染的植物時，它們的 VIGS可被誘導。煙草植物表達對咀嚼式昆蟲煙草天蛾(Manduca sexta)特異性dsRNA的反義片段的植物病毒TRV，昆蟲幼蟲取食這些植物后，能特異性沉默3個中腸表達的MsCYP RNAs。除了把植物病毒用作昆蟲特異性dsRNA傳遞介質，另一潛在VIGS方法為使用重組病毒，此重組病毒在寄主昆蟲體內能夠感染和復制。在感染后，工程化病毒穿過昆蟲細胞擴展，啟動RNAi，導致昆蟲基因特異性siRNA產生，隨后基因沉默。然而，此技術的應用需要確定在靶標害蟲體內能夠自發感染和復制的病毒，因為病毒基因組的復制和/或轉錄對啟動RNAi重要 。傳統使用病毒防治昆蟲(例如防治毛蟲的桿狀病毒)依靠發現有毒的高致病力的病毒品系，主要為品種特異性的，然而，非致病病毒能被工程化表達特異性dsRNA/siRNAs和直接傳遞到昆蟲種群。

田間使用dsRNA進行害物防治時，只有dsRNA為品種特異性和經濟有效才可行。噴霧應用dsRNA依賴于開發經濟有效方法大量生產 dsRNA和其制劑化。幸運的是生產dsRNA的費用在迅速下降。例如NTP合成法生產1 g dsRNA的費用從2008年的12 500美元到2016年的100美元到現在60美元。缺乏降解 dsRNA酶的大腸桿菌品系[HT115(DE3)]可被用于大量生產dsRNA。由于細菌能夠大量表達產生dsRNA，故細菌產生的dsRNA農藥可在任何時候噴霧用于作物。這可被認為是最經濟有效的生產dsRNA的方法(1 g約4美元)，因為對于大多數國家來說細菌生產 dsRNA是可以負擔得起的生產體系。最近，1個生物技術公司開發了名為“Apse RNA Containers(ARCs)”的技術，用細菌可大量生產膠囊化dsRNA，成本約為 2美元/g。質粒編碼天然產生的衣殼等蛋白可與另一質粒編碼的 daRNA序列和裝配點一起轉化。當細菌在培養中生長時，它們產生自己組裝在細胞中RNA周圍的蛋白質亞基，包括裝配點序列。在純化細菌后，得到的RNA在環境中穩定，能夠噴霧使用。由于缺乏田間試驗，每公頃需要的dsRNA的量和施用頻率仍未知，但預測每公頃使用量約為2～10 g。根據害物品種對RNAi敏感性、系統性 RNAi和制劑傳遞效率的不同，此數值可能差異很大。市場對dsRNA興趣的不斷增加會促進開發更好的生產體系，更有效的制劑和更低的成本。

5 RNAi對環境可能的影響

RNAi是正在出現的技術，為開發新穎害物防治策略和轉基因植物性狀帶來了新的機會。下一代RNAi產品將利用植物產生的dsRNA或噴霧于植物上的dsRNA使害物的基因表達被抑制。雖然如美國環保局和歐盟食品安全局(EU-EFSA)等大多數生物技術產品管理機構對于新引入的PIPs的生態風險評估有豐富的經驗(數年的 Bt作物評估)，但由于dsRNA獨特的作用機制，用相同評估方法可能不能評估dsRNA的生態風險或危險性。

RNAi的活性譜是基于序列的。這意味著當前缺乏許多現有生物的基因組數據，特別在 RNAi應用區域，這可能會阻礙對作物區域/農業生態系統中應用的RNAi技術的生態風險評估。雖然預期siRNA為獨特的，因此只沉默既定靶標基因，但已報道siRNA沉默非靶標品種的基因。通過PIPs或非PIPs傳遞的RNAi農藥的潛在風險可被分為脫靶(off-target)基因沉默、對非靶標生物基因沉默、RNAi機器的飽和和免疫刺激。

化學和微生物農藥以及Bt作物的環境風險一般用分層法評估。此方法常依賴于已知環境暴露濃度對不同非靶標指示性生物(例如傳粉昆蟲、捕食者和寄生者)的最大風險劑量測定。這些害物防治技術的作用機制已被詳細地介紹過，然而，siRNA可能會和非靶標生物的基因組進行脫靶結合。這可以預測毒性影響和設計對潛在暴露的大量生物的最大風險生測。雖然脫靶結合不是對靶標生物的關注，但如果非靶標生物充分暴露于噴霧的dsRNA或RNAi工程化植物，在非靶標生物體內的脫靶結合可能是RNAi的風險。此外，不同生物(靶標/非靶標)可能具有不同的RNAi機器，如使dsRNA穿過膜的受體、Dicer和 Argonaute。這些差異可在 RNAi機器的效率上看到。然而，這些酶如何作用和是否出現在非靶標生物體中的差異表明，以 1個害物為靶標的dsRNA如何在其他生物的RNAi途徑中起作用。因為 RNAi是基于序列的，由此可推斷出與靶標害物種系關系密切的非靶標生物受 RNAi方法影響的可能性較高。對以往所有RNAi技術性狀進行全面評估是檢測其風險的適宜方法。

siRNA對已知mRNA的特異性與它們序列同系性的最低水平有關，二者之間較好的序列同系性可導致對靶標mRNA的抑制。然而，抑制程度取決于選擇的 mRNA，2個分子間大量序列差異不能排除對mRNA基因的沉默。這在抗玉米根蟲的轉基因玉米中發現，也報道此玉米對其他數種甲殼蟲有作用。黃瓜十一星葉甲 (Diabrotica undecimpunctata)和馬鈴薯甲蟲(Leptinotarsa decemlineata)與玉米根蟲的這些基因的序列同系性只有79%和83%，以玉米根蟲v-ATPase A和E為靶標的dsRNA也對這2種害蟲的存活率降低約40%和45%。dsRNA的加工不是發生在固定的約 21個核苷酸間隔。外來的dsRNA序列被識別后可被 Dicer在任一核苷酸位置剪切，產生由系統RNAi機器產生的siRNA進一步填充大小和序列的潛在重疊的許多siRNA。siRNA多樣，故與不同mRNA靶標的siRNA/dsRNA有高度同源性的潛力，因此增加了脫靶標和非靶標效應。產生多個不同功能siRNA的dsRNA能抑制非靶標生物體中的基因，這已被證實。計算機方法表明當較長dsRNA序列(100-400 nt)被用于產生siRNA池，脫靶效應增加。這是因為dsRNA所固有的序列多樣性隨著其長度的增加而增加，導致更多樣的siRNA序列池。相同研究進一步表明所使用的品種[智人(Homo sapiens)、秀麗隱桿線蟲和粟酒裂殖酵母菌(Schizosaccharomyces pombe)]隨意產生的siRNA序列的 5%-80%能結合到 1個生物體中的非既定mRNA。如果dsRNA的長度與脫靶結合成正相關性，那么使用 siRNA(21-23 nt)能降低脫靶效應的可能性。一致大小的siRNA對靶標mRNA的特異性提高，但不排除對非靶標生物的脫靶效應。也發現 RNAi以一定的過剩進行作用。因此，能夠產生以害物mRNA為靶標的siRNA或miRNA，而不是被Dicer剪切的 dsRNA的轉基因植物是降低對非靶標潛在影響的策略。這也可降低沉默靶標基因的可能性。到目前為止，有證據顯示大多數RNAi轉基因植物產生的所有dsRNA被剪切為siRNA，除非轉基因植物在葉綠體中產生dsRNA。

siRNA中，前12個堿基由靶標識別序列組成。這表明在堿基2-12區域的錯配就會使siRNA對靶標mRNA的所有活性消失，此區域外的錯配可以忍受。顯然，必須以此區域為重點來選擇 siRNA，生物信息學在確定選擇序列的特異性方面有重要作用。雖然BLAST搜索容易、快速，但其不能夠特異搜索位置2-12，考慮到含有21-24 nt的 dsRNA的context，BLAST也不能評判短的非連續區域的同源性。而Smith-Waterman算法能被用于以迭代方式分析特異性位置，進行最佳局部對比，這可被用于短的引導序列的同源性分析?？紤]到潛在暴露于dsRNA PIP和噴霧的dsRNA中已知農業生態系統中或周圍的生物多樣性，生物信息學工具可用于確定潛在的脫靶和非靶標生物，但不應被用作對非既定影響的絕對預測工具。除了生物信息學，其他策略可能被用于降低 RNAi的潛在環境風險。例如，以O-甲基核糖基代替siRNA的種子序列的第二位置，進行化學修飾，降低但非消除脫標結合。已知有效的 RNAi所需的 dsRNA長度因昆蟲品種不同而變化。因此，這些脫靶/非靶標影響雖不能阻礙 RNAi作為農藥，但為了保護暴露的非靶標生物，必須對各個生物進行脫靶/非靶標影響研究。

6 結語和展望

近年，已看到昆蟲、蠕蟲、病原菌和雜草中RNAi沉默的多個功能作用，已開發應用于農業實踐。然而，如果要實現田間廣泛應用，需要解決多個問題。目前的挑戰為確定可能應用的最大程度，以及如何從研究發現轉化為田間應用。例如一個方法為開發微膠囊dsRNA，直接噴霧用于葉面防治毛蟲和鞘翅目昆蟲。此策略能增加dsRNA在環境中和被害蟲吸收期間的穩定性。大量生產dsRNA(例如細菌、ARC、植物和合成生產)的經濟有效的方法正在被開發，市場競爭將有助于降低成本。

dsRNA可被量身定做為作用于調節單個靶標品種或一組相關品種的基因表達的途徑，不影響有益和其他非靶標品種。此高度特異性是 RNAi的獨特特征，遠超過目前市場上作物保護策略的特異性，這是其主要優勢之一。在以后幾年，作物保護者可能會首次擁有高特異性和環境安全的策略，可大規模和小面積應用，適宜用于有機和非有機種植，成本低，可用于管理害蟲和植物病害。

確定靶標是 RNAi用于作物保護的重要一步。搜索在暴露于 dsRNA后導致害物死亡的靶標是困難的，特別是如果害物不是已建立的實驗室生物/模式昆蟲和/或如果沒有得到有關害物的充足的基因組工具和資源。昆蟲基因組學一直提供數量不斷增長的序列數據，由此就可快速確定潛在的靶標。目前，(2017年9月4日)對280個主要為昆蟲的脊椎動物基因組和1 000個真菌基因組的測序或已完成或在進行中，大部分基因組可在生物技術信息Entrez基因組計劃數據庫的國家中心(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/browse/)免費獲取。雖然數據序列有用，但只有數據序列還不充足，因此主要采用主動數據挖掘、RNAi 篩選分析和功能喪失型基因的篩選。例如，FLIGHT (http://flight. icr.ac.uk/)和 DRSC(http://www.flyrnai.org/)是在線數據庫，含有活體果蠅高通量篩選和離體 RNAi篩選數據。相似地，iBeetle-Base (http://ibeetle-base.unigoettingen.de)數據庫可用于搜索對赤擬谷盜(Tribolium castaneum)進行大規模RNAi篩選(約5 000個基因)所得到的 RNAi表現型。使用此數據庫可為作物保護科學家提供發現假定靶標的起點，然后必須以對靶標品種的研究以證實。對于還沒有獲得基因組的昆蟲，RNA測序等其他技術是費用承擔得起的篩選最佳RNAi靶標的方法。此外，把靶標縮小為一個單獨品種或一組相關害物品種(例如毛蟲或刺吸式昆蟲)而對有益生物和傳粉昆蟲沒有影響的能力也很有趣。軟件LAST (http://last.cbrc.jp/)被設計比較大的序列數據庫(例如整個昆蟲基因組/轉錄物組)。因此，通過比較靶標和非靶標品種數據庫，可能排除非靶標品種的直系同源的可能性。LAST發現基于多樣性而不是固定長度(例如BLAST使用11-mers)的最初匹配，是比較較多序列與基因組間同源性較好的方法。筆者相信這些工具能有助于確定特異性和敏感靶標，設計作物保護RNAi技術。

如上面所指出，確定重要靶標基因非常重要，因此表達水平的細微或短暫變化對靶標品種有嚴重的影響。這對于避免主要是濃度依賴型脫靶效應也重要，如上面對環境影響一節中所討論的。不考慮靶標生物的情況下，作物保護的RNAi策略需要持續供應RNA分子。轉基因植物能容易持續產生需要的dsRNA。研究表明轉基因植物發夾dsRNA能夠表達，但對每個靶標品種并不實用，例如多年生植物(例如柑橘和咖啡)，可能需要數年來開發和商業化。目前，正在努力使用天然產生的昆蟲或植物病毒/細菌來開發共生體介導的RNAi方法。通過引入dsRNA結構到致病力減弱或無致病力的病毒基因組中來獲得。對于昆蟲來說，共生體中腸細菌能有效引起寄主體內的 RNAi。當修飾的天然存在的病毒/細菌發生侵染，這將是RNAi啟動分子的持續來源。