山東北蟲草不同極性部位調節免疫能力研究

李 潔，劉敬民，李萬芳

（1. 山東中醫藥大學 中醫學院，山東 濟南 250355；2. 山東省農藥科學研究院，山東 濟南 250033；3. 山東協和學院，山東 濟南 250109）

北蟲草（Cordyceps militaris）在我國作為食藥 用真菌而廣泛應用[1]，其研究與開發在近 30 年取得了迅猛發展，其藥用價值和保健功能已被人們廣泛接受，市場需求正不斷擴大[2]。

現代科學研究表明，北蟲草含有蟲草多糖、核苷類、蟲草酸和超氧化物歧化酶（SOD）等多種生物活性物質[3]，具有增強細胞免疫、改善腎臟功能、抗腫瘤、延緩衰老等作用[4]。多項研究表明，這些作用均與免疫有關，通過影響機體免疫系統的多個環節，增強機體的免疫功能。目前鮮有關于北蟲草免疫活性部位篩選的文獻報道，尚不完全清楚山東北蟲草對機體免疫器官和巨噬細胞吞噬功能及抗體產生是否有影響。為篩選北蟲草子實體的免疫活性極性部位，本實驗采用系統溶劑法，分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和蒸餾水依次提取。采用小鼠腹腔巨噬細胞功能測定法、免疫器官重量法及淋巴細胞轉換率測定法，研究山東北蟲草對小鼠免疫器官、巨噬細胞吞噬功能及抗體產生的影響，全面了解其作用機制，以期為科學開發和利用北蟲草資源提供一定的實驗依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器

超聲清洗儀（昆山市超聲儀器公司）；真空干燥箱（南京瑞奧）；電熱恒溫水溫箱（金壇杰瑞爾電器）；臺式水平離心機（北京醫用離心機廠）；電子天平；解剖盤；手術剪；手術鑷；顯微鏡；計數器。

1.2 試劑

石油醚（60～90 ℃，天津廣成，批號：20160618）；乙酸乙酯（分析純，天津天大，批號：20150920）；正丁醇（天津廣成，批號：20151028）；植物血凝素（PHA，上海疾控生物科技，批號：20165802）；雞紅細胞（CRBC，自制）；羧甲基纖維素鈉（CMC-Na，武漢全康）；凡士林；鹽酸（國藥集團化學試劑公司，批號：20161127）；Giemsa-Wright 染色液（上海遠慕）；肝素（國藥集團化學試劑公司）；蒸餾水（自制）。

1.3 材料

北蟲草子實體石油醚提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物、水提取物（自制）。

1.4 實驗動物

1.4.1 實驗動物選擇 SPF級昆明種雌性小鼠160只，體重20±2 g，由山東中醫藥大學實驗動物研究中心提供。

1.4.2 實驗動物飼養管理 所有小鼠同室分籠飼養，溫度（20±1）℃，濕度 40 %～50 %，光-暗周期12 h，顆粒飼料喂養，自由飲水，實驗前飼養一周以適應環境。

2 方法

2.1 北蟲草子實體供試樣品制備

精密稱取上述各極性部位提取物適量，石油醚、乙酸乙酯提取物用0.5 % CMC-Na溶解；正丁醇、水提取物用蒸餾水溶解。

2.2 實驗動物處理

2.2.1 動物分組 將試驗動物按體重分為：石油醚組、乙酸乙酯組、正丁醇組、水提取物組。每組按體重隨機分為：空白對照組，高、中、低劑量組，每組10只動物，每日1次連續灌胃30 d，空白對照組給予等體積蒸餾水?？辔端針擞?。

2.2.2 免疫處理 試驗結束前3 d，各組腹腔注射生理鹽水稀釋過的PHA，劑量為0.3 ml/只。實驗當天，每只小鼠腹腔注射1 % RBC生理鹽水溶液進行免疫，劑量為1 ml/只。

2.3 不同極性提取物對小鼠免疫功能的影響實驗

2.3.2 免疫器官指數測定 小鼠飼喂4周后，稱重，頸椎脫臼處死，解剖動物，迅速取其免疫器官胸腺和脾臟，用濾紙吸去血漬，去除周圍組織和脂肪等，稱其濕重，計算免疫器官的指數。

2.3.3 小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞實驗 每只小鼠腹腔注射1 % CRBC 1 ml，頸椎脫臼處死，固定于手術臺上，消毒腹部皮膚，吸出腹腔洗液l ml，平均分滴于2片玻片上，37 ℃溫育30 min，用生理鹽水漂洗，以除去未貼片細胞，晾干，以1:1丙酮甲醇溶液固定，4 %（v/v）Giemsa-磷酸緩沖液染色3 min，再用蒸餾水漂洗晾干，油鏡下記數巨噬細胞，每張片記數100個，按下式計算吞噬百分率和吞噬指數。

2.3.4 小鼠淋巴細胞轉化實驗 實驗前3 d，每只小鼠腹腔注射PHA 0.3 mg。3天后，小鼠斷尾取血至玻片一端，另取一載玻片推片，自然干燥后，Giemsa-Wright 染液染色，再用生理鹽水沖洗，用濾紙將標本吸水干燥后，鏡檢。

淋巴細胞轉化率＝轉化淋巴細胞／（轉化淋巴細胞+未轉化淋巴細胞）×100%

2.4 統計學分析

使用SPSS19.0軟件對實驗所得的數據進行統計處理。試驗數據以±s表示，采用組間t檢驗進行處理，以P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 體重測定

實驗開始和結束時，分別將小鼠稱重。記錄樣品各組小鼠的體重與對照組比較。結果見表1。

表1 北蟲草不同極性部位對小鼠體重的影響/g（ ±s，n=10）

表1 北蟲草不同極性部位對小鼠體重的影響/g（ ±s，n=10）

組別 劑量 初始體重 終期體重 P石油醚提取物組對照組 18.6±0.5 35.1±1.3 -低劑量組 19.0±0.5 34.9±1.2 0.716中劑量組 21.1±0.5 35.4±1.7 0.823高劑量組 20.9±0.5 34.7±1.8 0.745乙酸乙酯提取物組對照組 19.1±0.5 35.7±1.4 -低劑量組 18.7±0.6 34.8±2.1 0.542中劑量組 21.0±0.6 35.1±2.2 0.697高劑量組 19.2±0.5 35.2±1.7 0.619正丁醇提取物組對照組 19.5±0.5 35.2±1.9 -低劑量組 19.4±0.6 35.1±2.3 0.463中劑量組 18.7±0.5 35.3±1.8 0.724高劑量組 19.3±0.6 35.3±1.5 0.497水提取物組對照組 18.6±0.5 34.9±1.6 -低劑量組 19.2±0.6 35.4±2.1 0.447中劑量組 20.8±0.6 35.3±1.4 0.835高劑量組 19.4±0.5 34.8±1.6 0.608

由表1可見，各樣品低、中、高劑量組小鼠終期體重與對照組相比，差異均無統計學意義。

3.2 免疫器官指數測定

各組小鼠稱重后處死，取出胸腺、脾臟，稱其濕重，計算胸腺指數和脾臟指數。結果見表2。

表2 胸腺指數、脾臟指數的測定結果（±s，n=10）

表2 胸腺指數、脾臟指數的測定結果（±s，n=10）

提取物組 對照組 1.671±0.052 - 2.497±0.046 -低劑量組 1.704±0.038 0.742 2.552±0.037 0.413石油醚中劑量組 1.753±0.044 0.626 2.581±0.043 0.315高劑量組 1.746±0.053 0.635 2.544±0.052 0.523乙酸乙酯提取物組 對照組 1.658±0.046 - 2.489±0.045 -低劑量組 1.713±0.037 0.583 2.553±0.043 0.533提取物組 對照組 1.667±0.055 - 2.491±0.042 -低劑量組 1.723±0.039 0.620 2.547±0.037 0.313中劑量組 1.750±0.043 0.737 2.578±0.034 0.611高劑量組 1.744±0.052 0.694 2.541±0.053 0.524正丁醇中劑量組 1.754±0.045 0.514 2.582±0.035 0.512高劑量組 1.747±0.053 0.538 2.554±0.049 0.520水提取物組對照組1.677±0.057-2.493±0.054-低劑量組1.720±0.038 0.518 2.553±0.032 0.347中劑量組 1.759±0.041 0.566 2.585±0.036 0.416高劑量組 1.748±0.054 0.575 2.549±0.053 0.463組別 劑量 胸腺指數/mg·g-1P脾臟指數/mg·g-1P

由表2可見，各樣品低、中、高劑量組胸腺指數和脾臟指數與對照組相比，差異均無統計學意義。

3.3 北蟲草不同極性部位對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞的影響

用不同劑量的北蟲草不同極性部位提取物灌胃小鼠30 d，油鏡下記錄各組小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞的能力，結果見表3。

表3 北蟲草不同極性部位對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能的影響（ ±s，n=10）

表3 北蟲草不同極性部位對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能的影響（ ±s，n=10）

組別 劑量組 吞噬率/% P 吞噬指數石油醚提取物組對照組 32.6±7.1 - 0.69±0.21低劑量組 33.6±11.4 0.315 0.75±0.33中劑量組 36.4±13.8 0.197 0.78±0.29高劑量組 40.3±12.7 0.104 0.84±0.31乙酸乙酯提取物組對照組 30.5±8.4 - 0.71±0.18低劑量組 31.6±9.7 0.542 0.78±0.22中劑量組 33.4±10.8 0.116 0.88±0.18高劑量組 35.4±10.3 0.105 0.84±0.20水提取物組 對照組 31.7±8.1 - 0.79±0.24低劑量組 48.6±11.6 ＜0.05 1.05±0.33中劑量組 59.4±13.8 ＜0.05 1.58±0.49高劑量組 39.3±10.7 0.079 0.83±0.30對照組 33.4±8.5 - 0.74±0.14低劑量組 37.6±11.7 0.542 0.95±0.23中劑量組 42.7±12.8 ＜0.05 1.05±0.27高劑量組 45.4±12.5 ＜0.05 1.16±0.32正丁醇提取物組

由表3可見，與對照組相比，北蟲草乙酸乙酯部位中劑量和高劑量對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞的吞噬率有增加作用（P＜0.05）；北蟲草水提取部位低劑量和中劑量對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞的吞噬率和對照組相比有顯著性差異（P＜0.05），也有增強小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能的作用。

3.4 北蟲草不同極性部位對小鼠淋巴細胞轉化率的影響

用不同劑量的北蟲草不同極性部位提取物灌胃小鼠30 d，油鏡下記錄各組小鼠淋巴細胞轉化率，結果見表4。

表4 北蟲草不同極性部位對淋巴細胞轉化率的影響（±s，n=10）

表4 北蟲草不同極性部位對淋巴細胞轉化率的影響（±s，n=10）

組別 劑量組 淋巴細胞轉化率/% P石油醚提取物組對照組 37.6±2.1 -低劑量組 42.4±2.7 0.228中劑量組 48.3±2.8 ＜0.05高劑量組 65.4±2.5 ＜0.05乙酸乙酯提取物組對照組 35.9±3.6 -低劑量組 45.3±2.9 0.155中劑量組 55.1±2.6 ＜0.05高劑量組 67.2±3.7 ＜0.05正丁醇提取物組對照組 37.1±3.4 -低劑量組 41.5±3.8 0.518中劑量組 42.6±2.2 0.502高劑量組 45.5±2.3 0.473水提取物組對照組 36.4±2.8 -低劑量組 51.6±3.7 ＜0.05中劑量組 72.4±2.4 ＜0.05高劑量組 43.4±2.6 0.204

由表4可見，與對照組相比，北蟲草石油醚部位和乙酸乙酯部位中劑量和高劑量對小鼠淋巴細胞轉化率有增加作用（P＜0.05）；北蟲草水提取部位低劑量和中劑量對小鼠淋巴細胞轉化率和對照組相比有顯著性差異（P＜0.05）也有增加小鼠淋巴細胞轉化率的作用。

4 討論

免疫是指機體通過免疫應答排除抗原性異物，或被誘導呈免疫耐受狀態以維持機體內環境的平衡和穩定[5]。免疫系統具有免疫防御、免疫自穩和免疫監視功能，可清除入侵病原生物及病毒感染細胞，殺傷腫瘤細胞并進行免疫調節。故此，若藥材提取成分可作用于免疫系統的不同環節和相應組織、細胞及分子，即可有效提高機體免疫力，對抗感染及腫瘤等。

本研究表明，北蟲草乙酸乙酯部位和水提取部位具有增強小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞功能的作用，也有增加小鼠淋巴細胞轉化率的作用，從而說明對小鼠的適應性免疫有促進作用。這兩個部位活性成分研究最多的是蟲草多糖和蟲草素。蟲草多糖被認為是當前世界上最好的免疫促進劑之一[6]。蟲草素是一種核苷類抗菌素，在抗癌抑瘤、調節免疫系統、抗菌抗炎、降血糖、降血脂等方面的研究取得了突破性進展[7]。亦有研究證實蟲草乙酸乙脂提取物的抗過敏機制與抑制磷酸化Syk，ERK，p38和JNK等蛋白表達相關[8]，而蟲草水提物能通過激活巨噬細胞NF-κB，增強NO的生成和促炎性細胞因子IL-1β，IL-6，TNF-α和PGE2的表達，是一個良好的免疫增強劑[9]。這與本實驗的研究結果相吻合。

對山東北蟲草石油醚提取部位進行GC-MS分析[10]：北蟲草石油醚提取部位中含有長鏈不飽和脂肪酸類，其中亞油酸相對含量高達63.28 %。文獻報道，許多不飽和脂肪酸除了能殺傷腫瘤細胞外，還能參與體內的免疫調節[11]，本實驗證實了這一點，為進一步研發北蟲草的臨床藥品、保健食品以及相關領域的應用提供了科學數據。

相比價格昂貴、資源貧乏的天然冬蟲夏草來說，北蟲草價廉易得、資源豐富，但是其生物活性物質基礎是什么，活性成分的化學結構以及作用機制值得進一步研究。本試驗結果將對科學開發和利用北蟲草資源提供一定的實驗依據。