農產品中棉酚的檢測技術研究進展

李凌慧,魏 月,呂 佼,楊舒妍,馬晶軍

(河北農業大學理工學院,河北滄州 061100)

棉酚是一種淡黃色的化合物,主要存在于棉花植物的根、莖、葉和種子內,植株的不同部位所含棉酚含量為0.04%～1.3%[1],棉籽仁中棉酚含量最高,大約為0.3～20 g/kg[2-3]。自然界中,棉酚主要以游離棉酚和結合棉酚形式存在[4],游離棉酚具有一定毒性,結合棉酚是游離棉酚與氨基酸、小肽等分子結合后形成的不具毒性的衍生化合物[5],通常不會對人體健康造成危害,生成的棉酚衍生物還具有改善糖尿病、抗生育、抗氧化活性、抗腫瘤及作為抗腫瘤藥物、抗癌等醫用價值[6-10]。棉籽粕作為質優價廉的動物飼料蛋白源之一[11-12],被畜禽大量攝入時,其中含有的游離棉酚會使畜禽出現食欲減退,呼吸困難,受精率下降等癥狀[13],并通過食物鏈的作用,蓄積在肉、蛋、奶等食物中,間接威脅人類健康。例如,雛鴨的飼料中游離棉酚含量達到320 mg/kg就會導致棉酚在雛鴨體內蓄積,損傷肝臟并且破壞代謝系統的正常運行[14]。2013年10月臺灣大統長基食品公司被查出造假“黑心油”事件,其中粗制棉籽油高達5828.62 t,長期食用這種油的人就會出現棉酚中毒的癥狀[15]。

外國學者在檢測農產品中棉酚是否存在及其含量方面的研究較少,大多都研究棉酚及其衍生物在醫學領域的應用,這可能與中西方飲食文化差異有關。隨著我國對農產品中棉酚危害認識不斷加深,先后提出并修訂了GB 13078-2017[16]和GB 2716-2005[17]兩個國家標準,檢測棉酚的技術也在不斷發展,本文主要概述電化學分析技術、光譜分析技術、色譜分析技術和分子印跡技術的定量分析方法在農產品中棉酚含量檢測領域的研究進展,為后期農產品中棉酚的定量分析研究提供一定的參考。

1 電化學分析法

電化學分析是儀器分析的重要組成部分之一。電化學分析法是根據物質在溶液中的電導、電勢等電化學性質而建立的一類分析方法,電化學分析具有儀器設備簡單、測量范圍寬、操作方便等優點,便于與自動化技術聯用容易實現自動化,易于微型化,適于現場測量,在食品質量安全檢測中被廣泛應用[18-20]。

1.1 極譜法

極譜法通過測定電解過程中所得到的極化電極的電流-電位(或電位-時間)曲線來確定溶液中被測物質濃度的一類電化學分析方法。極譜法是使用滴汞電極或其他表面能夠周期性更新的液體電極為極化電極,分為控制電位極譜法和控制電流極譜法兩大類。1922年,捷克化學家J.海洛夫斯基建立了極譜法[21],早在1984年,姜永等[22]介紹了極譜法測定棉酚的方法,通過改進測定條件,使實驗結果的靈敏度更高。極譜法可用來測定大多數金屬離子、陰離子(如F-、Cl-、I-)和有機化合物,在生物化學方面也有廣泛的應用,具有適用范圍廣、精確度高、靈敏度高的特點[23],但極譜法使用汞電極會產生汞蒸氣,危害人體健康,實驗室應注意通風,所以此方法很少用于棉酚的定量分析。

1.2 庫侖法

庫侖分析法是以測量電解過程中被測物質在電極上發生電化學反應所消耗的電量來進行定量分析的一種電化學分析法,分為控制電位庫侖分析法和恒電流庫侖滴定法。1985年,姜永等[24]建立了TLC—溴庫侖法測定棉籽中棉酚的方法,結果表明庫侖法可以消除棉酚類似物的干擾,可用于棉酚樣品及其制劑的測定。但是庫侖分析法具有一定局限性,必須保證電極反應專一,電流效率100%才可以使用此方法。以上兩種電化學分析法因具有各自的局限性,目前不再被用于棉酚的檢測,但隨著電子技術的發展,這可能為研究出新型電子檢測技術提供依據。

2 光譜分析法

光譜分析方法是基于物質與輻射作用時,測量由物質內部發生的能級躍遷而產生的發射、吸收或散射輻射的波長和強度,以此來鑒別物質及確定它的化學組成和相對含量的方法[25],光譜法分為吸收光譜法和發射光譜法兩類。定量研究棉酚在農產品中的含量大多采用原子吸收法、近紅外光譜分析法和紫外可見分光光度法。

2.1 原子吸收法

原子吸收光譜法是具有待測元素特征波長的光通過試樣原子蒸氣時,被測元素的基態原子所吸收,然后利用光被吸收的程度來測定被測元素含量的方法。原子吸收法更適合于定量分析,它是利用待測元素所產生的基態原子對其特征譜線的吸收程度來進行定量分析的,原子吸收法靈敏度高、精密度高、選擇性好、干擾少并且應用范圍廣。董仕林等[26]應用原子吸收法測定棉籽油中游離棉酚,方法的檢出限為100 μg/kg,平均回收率為99.8%,儀器的相對標準偏差為4.2%～6.8%。這種方法檢測農產品中棉酚,精確度不高,穩定性相對較差,難以檢測痕量棉酚,且儀器占地面積大、消耗材料貴。

2.2 近紅外光譜法

近紅外光譜分析技術被譽為化學分析領域的“巨人”,現如今發展迅速,在光譜分析技術中占有很重要的地位[27],通過掃描樣品的近紅外光譜,可以得到樣品中有機分子含氫基團的特征信息,而且利用近紅外光譜技術分析樣品具有方便、快速、高效、準確和成本較低,不破壞樣品,不消耗化學試劑,不污染環境等優點。Cheng Li等[28]使用近紅外光譜聯合蒙特卡羅無信息變量消除法與非線性多元校正相的方法聯合可以快速、準確的定量分析棉籽中棉酚含量,預測均方根誤差(RMSEP)為0.0422,決定系數(R2)為0.9331,殘差預測偏差(RPD)為3.8374。由于棉酚在近紅外區的吸收系數小,因此,紅外光譜法對農產品中的痕量棉酚進行定量分析應用較少。

2.3 紫外可見分光光度法

紫外—可見分光光度計可以對物質的組成、含量和結構進行分析、測定和推斷,應用廣泛,不僅可以進行定量分析,還可以利用吸收峰的特性進行定性分析和簡單的結構分析,靈敏度高、準確度高、選擇性好、操作方便、分析速度快、應用范圍廣。1988年,張紹衡等[29]建立了紫外分光光度計測定棉籽油中的游離棉酚的方法,此方法的檢出限為5000 μg/kg。這種方法雖然操作簡單,但樣品處理復雜,易受雜質干擾,棉籽油樣品易乳化,使檢測值偏高。田秀蕓等[30]在此基礎上改進了前處理方法,用Mg(NO3)2作為破乳劑以消除乳化現象,分析的準確度與精密度均符合定量分析的要求。2017年,Daminato B等[31]建立了一種快速、簡便的檢測棉籽粕中棉酚含量的方法,基于流動注射分析系統,在660 nm下進行分光光度檢測,實現了對棉籽粕固體樣品的直接分析。紫外分光光度法對樣品純度要求高,待測樣品中含有雜質或檢測基質復雜的樣品時會產生較大的偏差,靈敏度不高。

3 色譜分析法

色譜分析法是利用物質的物理性質進行分離和分析的檢測方法,被廣泛應用于環境、材料、食品等各個科學領域,用于多組分復雜混合物的分離分析,具有速度快、效率高、選擇性高和應用范圍廣的特點。用于檢測農產品中棉酚含量的色譜分析法主要有高效薄層色譜法、高效液相色譜法和超高效液相色譜串聯質譜法三種。

3.1 高效薄層色譜法

高效薄層色譜法與普通薄層色譜法相比具有分辨效率高、分析時間短和檢出靈敏度高的優點,因操作簡單方便被應用于許多物質的檢測。沈靜等[32]用高效薄層色譜法測定棉籽油中游離棉酚含量,結果表明棉酚對照品溶液在8～128 μg/mL范圍內與峰面積呈良好的線性關系,平均回收率為91.5%～100.2%。結果表明薄層掃描法測定棉籽油中游離棉酚含量,方法準確、簡單、可行。此方法具有使用方便、快速、再現性好等優點,但是對生物高分子分離效果不好,結果準確可靠但精確度不高,難以實現痕量棉酚的檢測。

3.2 高效液相色譜法

高效液相色譜法(HPLC)是在氣相色譜和經典液相色譜的基礎上發展起來的,液相色譜分離系統由固定相和流動相組成。HPLC具有高選擇性、靈敏度高、分析速度快、重復性好、應用范圍廣等優點,已成為現代分析技術的重要手段之一。李東雨等[33]HPLC內標法檢測牛乳中游離棉酚的方法,以甘草次酸為內標物,檢出限為4 μg/kg,RSD小于2%,平均加標回收率為102.3%～103.0%,該實驗對烏魯木齊市各散裝牛乳點樣品進行檢測,未檢出游離棉酚。宣巖芳等[34]用HPLC法檢測雞蛋中游離棉酚和總棉酚的含量,在0.1～50.0 μg/mL范圍內線性關系良好,加標回收率為89.6%～91.7%,相對標準偏差為1.10%～4.06%(n=6),檢出限為200 μg/kg,定量限為500 μg/kg。Karishma R等[35]使用HPLC對不同棉花品種棉籽中棉酚含量進行測定,并成功檢測出棉籽中游離棉酚和總棉酚的含量。姚軍等[36]建立了家兔血漿中棉酚的HPLC測定方法,平均加標回收率為95.7%～96.3%,檢出限為200 μg/kg,采用丙酮-乙腈-正庚烷-磷酸鹽溶液提取家兔血漿中游離棉酚,為生物體內棉酚的測定提供了可靠的分析方法。雖然HPLC的分析成本較高,但是它可以通過優化流動相的組成實現多組分分析物的分離,并實現對痕量棉酚的檢測,儀器的靈敏度、精密度均高于高效薄層色譜法。

3.3 液相色譜-串聯質譜法

以超高效液相色譜(UPLC)、高效液相色譜(HPLC)或液相色譜(LC)作為分離系統,串聯質譜(MS/MS)作為檢測系統的液相色譜和質譜聯用技術在藥物分析、食品分析和環境分析等許多領域得到了廣泛的應用。液相色譜和質譜聯用技術利用色譜對復雜樣品的高分離能力,與質譜或光學儀器的高選擇性、高靈敏度的特點,將分離技術與目標物分子結構信息相結合的方式成功地應用于痕量棉酚的定性、定量分析工作中。Zhang W[37]等用高效液相色譜串聯質譜HPLC-MS/MS外標法定量檢測食用油中棉酚含量,定量限為100 μg/kg,加標回收率為87.4%～100%,穩定性高,相對標準偏差為3.9%～12.2%,實驗結果準確可靠,穩定性好。袁潔等[38]等用LC-MS/MS法測雞肝中棉酚旋光異構體,線性范圍為0.1603～8.015 μg/mL,檢出限為1.2 μg/kg,回收率在80.1%～115.0%之間,相對標準偏差小于11%,驗證了此方法的高靈敏度和精密度。施琦貽[39]建立了HPLC-ESI-MS/MS技術檢測鮮蛋黃中的棉酚殘留,線性范圍為1～100 ng/mL,加標回收率在85%～100%之間,對標準偏差(n=6)小于10%,精密度相對較好。姚軍等[40]建立了高效液相色譜串聯質譜(HPLC-MS)檢測棉籽仁中左旋和右旋棉酚含量的方法,以(R)-(-)-2-胺基-1-丙醇為手性拆分試劑進行柱前衍生化反應,左旋和右旋棉酚的檢出限分別為2.52、3.41 μg/kg,平均加標回收率為99.4%～103.0%。LC-MS/MS檢測方法具有靈敏度高,分析時間短的優點,但是儀器價格和日常維護費用昂貴,分析成本較高,限制了此方法檢測農產品中棉酚含量的推廣使用。

3.4 高效毛細管電泳法

高效毛細管電泳法(HPCE)是依據樣品中各組分之間淌度和分配行為上的差異而實現分離分析的液相分離方法。郭玉娟等[41]建立了高效毛細管電泳法檢測棉籽油中游離棉酚含量的方法,線性范圍為10～100 μg/mL,平均回收率為99.4%～100.2%,精密度RSD為1.2%,檢出限為1000 μg/kg。該方法精密度較好、檢出限低、準確度高,適用于棉籽油中游離棉酚含量的檢測。

4 分子印跡技術

分子印跡技術作為一種新的分析檢測技術,可以滿足快速檢測的要求,且靈敏性高、成本低,具有預定性、特異識別性和廣泛實用性的特點。2014年,趙晨等[42]設計了具有PMAA/SiO2結構的表面分子印跡聚合物來檢測棉酚,使用色譜分析的方法對制備的印PMAA/SiO2跡聚合物的容量因子進行了檢測,并與高效液相色譜串聯紫外檢測器(HPLC-UV)的容量因子進行了比較,得出MIP-PMAA/SiO2對棉酚檢測的效果要優于HPLC-UV。為了減小棉酚的檢測周期,降低檢測成本,Chen Z等[3]提出了一種新型壓電分子印跡傳感器,對棉酚和其相似物進行檢測,最低檢測限6 μg/kg,結果表明壓電型分子印跡傳感器具有的特異性和靈敏性。分子印跡技術檢測成本低,檢出限低,使用壓電型分子印跡傳感器是極具潛力的測定農產品中棉酚含量的方法。

5 結論與展望

綜上所述,本文從電化學分析技術、光譜分析技術、色譜技術、分子印跡技術等方面闡述了定量分析農產品中棉酚含量的檢測技術及特點,并對部分檢測方法的檢出限進行比較,見表1。由表1可知,高效液相色譜法、高效液相色譜串聯質譜技術的檢出限相對較低,檢測樣品的樣品基質不同也可能對結果有一定影響,高效液相色譜和高效液相色譜串聯質譜技術檢出限低、精密度高,聯合分子印跡技術的壓電型分子印跡傳感器檢測棉酚的成本低較。上世紀80年代有人嘗試使用電化學分析法檢測棉酚,這種方法的檢測結果與現在先進檢測技術的檢測結果相比并不理想,但目前電子技術發展迅速,這可能為研究出用于檢測農產品中棉酚的最佳電子技術提供參考。

表1 不同檢測方法檢測棉酚的檢出限Table 1 Detection limit of gossypol by different detection methods

農產品中棉酚的檢測技術發展較快,應根據農產品樣品的本質屬性與實驗條件,選擇較為合適的檢測方法對毒性棉酚進行提取與測定。未來可以將新型前處理技術應用到復雜基質的農產品的樣品中,例如石墨烯吸附法、QuEChERS提取法、懸浮固化微萃取等低填料、低溶劑量的前處理方法等,并結合快速、高效、準確的檢測技術,以實現對痕量棉酚的檢測。近年來,隨著科技的進步與創新,農產品中棉酚的檢測技術也在不斷更新,試劑盒也已成為快速檢驗化合物的生物學方法,為棉酚的快速檢測方法提供了新方向。因此,建立更加準確、高效、綠色的分析方法仍然是農產品中棉酚含量檢測領域的一個重要發展趨勢。