雙效工程菌Y1溶藻產物的急性毒性與健康風險評估

潘瑞松 沈紅池 吳旭鵬 蔡慶慶 王明新 張文藝

摘 要：

為檢測溶藻、藻毒素降解雙效工程菌Y1溶藻產物的生物毒性，采用發光細菌測定急性毒性，利用USEPA推薦模型對水源水進行健康風險評估。結果表明，Y1溶藻菌液能有效地抑制銅綠微囊藻的生長，并對發光細菌具有輕微的毒性。當葉綠素a濃度為34.92 mg/m3時，增加投加量會使藻液毒性加強；當葉綠素a濃度大于46.56 mg/m3時，加菌后藻液毒性明顯降低。水源水中MCLR的非致癌風險值為2.89～4.87，通過BAF處理后能減少到1.3，而加Y1菌強化后得到的0.6達到了健康風險評估安全標準。UV254與致突變強度的預測模型表明經過處理的水中有機物無致突變性，說明Y1應用于水源水無生物毒性和致突變風險。

關鍵詞：發光細菌；葉綠素；藻毒素；急性毒性；健康風險評估

中圖分類號：X703

文獻標志碼：A 文章編號：16744764（2018）05014106

收稿日期：20171115

基金項目：

國家自然科學基金（41571471），江蘇省及常州市科技支撐項目（BE2016653、WS201621、CE20175009）

作者簡介：

潘瑞松（1968），高級工程師，主要從事飲用水安全保障研究，Email：326664395@qq.com。

張文藝（通信作者），男，博士、教授，Email：zwy@cczu.edu.cn。

Received：20171115

Foundation item：

National Natural Science Foundation of China（No.41571471），Jiangsu Province and Changzhou Science and Technology Support Project（No.BE2016653，WS201621，CE20175009）

Author brief：

Pan Ruisong（1968），senior engineer， main research interest： urban drinking water safety，Email：326664395@qq.com.

Zhang Wenyi（corresponding author）， PhD， professor，Email：zwy@cczu.edu.cn.

Acute toxicity of the algaelying products and assessment on health

risks of microcystin in drinking water sources

Pan Ruisong1，2，Shen Hongchi1， Wu Xupeng1， Cai Qingqing1，

Wang MingXin1， Zhang Wenyi1

（1.School of Environmental & Safety Engineering， Changzhou University， Changzhou 213164， Jiangsu， P. R. China；

2.Changzhou Environmental Protection Technology Exploitation and Development Center， Changzhou 213022， Jiangsu， P. R. China）

Abstract：

In order to detect the toxicity of algicidal products and valuate the harm of microcystin in the water source to the human body， the luminescent bacteria was to determine the toxicity， USEPA recommended model provided a health risk assessment of source water. The results show that the strain Y1 inhibit the growth of microcystis aeruginosa effectively. The strain had a slight toxicity to the luminescent bacteria. When the concentration of chlorophyll a was 34.92 mg/m3， the increase of dosage could enhance the toxicity of algae. The toxicity of liquid algae added bacteria was significantly lower than that of the control group， when the concentration of chlorophyll a was greater than 46.56 mg/m3. The non carcinogenic risked index of MCLR in the water source was 2.89～4.87， which was reduced to 1.3 after BAF treatment， even to 0.6 after adding strain Y1. It reached health risk assessment safety standards when the the value was less than 1. Through the prediction model， it was found that the organic matter in treated water had no mutagenicity， it indicated that waters with strain Y1 had not biotoxicity and mutagenicity.

Keywords：

luminescent bacteria；chlorophyll；microcystin；acute toxicity；health risk assessment

中國南方飲用水多取自于淡水湖泊、河流及水庫。隨著水體富營養化的加重，水源地藍藻爆發日益頻繁[12]。藍藻爆發不僅導致水質下降，還會產生藻毒素，其中微囊藻毒素（Microcystins，MCs）具有極強的肝、腸致癌毒素，嚴重危害著人們的健康，所以保護水源水迫十分急迫[35]。生物法是近年來興起的、利用溶藻細菌控制水體藻類繁殖的一種控藻方法，其基本控藻機制一是通過直接與藻接觸殺藻，二是通過菌分泌的胞外物質殺藻[67]。但對溶藻產物及藻溶解后生物殘留物的急性毒性、健康風險和致突變鮮有研究[8]。

發光細菌是一種在自然狀態下能夠發出熒光的細菌，現廣泛應用于水、土壤、沉積物等方面的毒性測定，是一種快捷、高效、廉價的毒性測試方法[911]。健康風險評價是評價人體長期攝入某種有害物質后對人類造成的傷害[1214]。而為了確保居民飲用水安全，對含MC的水可能造成的危害進行健康風險評價是十分必要的。健康風險評價采用模型計算有毒物質對人群的影響，美國（USEPA）推薦的模型是較為常用的評估模型[1516]。

將已構建的溶藻和藻毒素雙效工程菌Y1制成菌劑，利用發光細菌研究其對銅綠微囊藻降解產物的毒性。采用美國環保署EPA推薦的健康風險模型——有機物致突變強度的預測模型公式[15]對水源水、曝氣生物濾池（BAF）處理水和Y1菌劑強化處理水進行健康風險評估。

1 材料與方法

1.1 菌劑培養基和菌種

1）菌種：采用本課題組專利“一種溶藻/藻毒素降解雙效工程菌Y1及其構建方法（專利201310419121.5）”中的菌劑Y1菌（Bacillus sphaericus，保藏號CGMCC NO.7519）。

2）培養基：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，NaCl 15 g，蒸餾水1 L，pH 7.2～7.4。

1.2 銅綠微囊藻來源及培養

選用的藻種為銅綠微囊藻（M.aeruginosa）FACHB905，購于中科院武漢水生生物研究所國家淡水藻種庫。將購買的藻靜置于光照培養箱中培養，培養箱條件：溫度28℃、光照強度2 500 lx、光照周期比12 h∶12 h。

1.3 菌劑Y1制備方法

用接種環取斜面培養基上的Y1菌置于高壓滅菌后的液體培養基內在140 r·min-1的震蕩箱內恒溫震蕩24 h。

1）菌液投加比對溶藻產物的急性毒性試驗 將培養18 h的菌液分別以菌藻比1∶5，1∶10，1∶20的量投加，并于溫度28 ℃、光強2 500 lx、光暗周期12 h∶12 h條件下，在光照培養箱中靜置培養，取樣測定葉綠素a的濃度和培養液急性毒性。

2）初始藻液質量濃度的溶藻產物急性毒性試驗 將培養18 h的菌液分別以菌藻比1∶10的量投加到不同初始濃度的新鮮藻液中，并于溫度28 ℃、光強2 500 lx、光暗周期12 h∶12 h條件下，在光照培養箱中靜置培養，取樣測定葉綠素a的濃度和培養液急性毒性。

1.4 檢測方法

1）葉綠素a的測定：Chla測定[17]：參照國家環?？偩志幍摹端蛷U水監測分析方法（第四版）》，其中的丙酮用乙醇代替。

2）發光細菌急性毒性測定：發光細菌遇到毒性物質，發光會受到抑制。對照和樣品均設兩個平行管，將管子按照順序排布，凍干菌劑用稀釋液活化15 min后，加100 μL到每個試管中，過15 min后測空白。以NaCl稀釋液作為對照，2 000 μL待測樣品加入200 μL調解液混勻，兩個平行管每管900 μL，過15 min后測發光亮。

cF=b/a

e%=c×cF-d/c×cF×100%

相對發光度%=1-e

式中：a為對照組的空白；b為對照組測定數據；cF為對照組的相對剩余發光度；c為樣品組的空白；d為樣品組測定數據；e為光損。

1.5 BAF處理水源水健康風險評價方法

國際癌癥研究署（IARC）將化學物的分類為Ⅰ級（致癌）、ⅡA級（很可能致癌）、ⅡB級（可能致癌）、Ⅲ級（無法歸類）和Ⅳ級（很可能不致癌）。MCLR屬于ⅡB級，對人類致癌性證據有限[18]。非致癌風險值計算公式為[19]

R=CDIRfD（1）

式中：RfD為MCLR進入人體的參考劑量（mg/kg·d）。目前尚無MCLR的RfD的值，國際上通用0.04 μg/（kg·d）作為其值；CDI為長期通過飲用水方式每日每千克體重下的攝入量mg/（kg·d）。

在飲水途徑暴露下，CDI的計算公式為

CDI=C×IR×EF×EDBW×AT （2）

式中：C為水源水中MCLR所存在的濃度，mg/L；IR為成人飲水率，USEPA建議值為2 L/d；EF為暴露于致癌物質的頻率，即接觸含MCLR水的頻率，定該值為365 d/a；ED為接觸MCLR總共所持續的時間，USEPA推薦的數值為30 a；BW為攝入MCLR的人體體重，通過國家標準設為60 kg；AT為接觸引用水的時間，對于非致癌健康風險該值為ED×365 d/a[20]。

1.6 有機物致突變強度的預測模型

研究表明水質參數如氮磷、COD、pH和 UV254等數值與致突變強度有密切聯系。學者們就水質參數與致突變強度（Mutation Rate，MR）建立了多種模型[21]。建立水質參數與致突變強度的預測模型能為水環境監測部門提供檢測水質毒性強度的便捷方法。有關于UV254與致突變強度的預測模型，在此模型中以UV254數值作為自變量，以定量水樣致突變強度為因變量。多項研究揭示了UV254和溫度與水質有機物致突變強度有較高的相關性。本研究采用多元回歸方程

MR=12.749×UV254+0.054×temp+0.312，引入UV254和溫度2個指標[22]。

2 結果與討論

2.1 菌液投加比例對溶藻產物的急性毒性

將初始葉綠素a濃度34.92 mg/m3的藻液加入不同菌量于28 ℃光照培養箱內培養6 d，測定空白樣和加菌樣的葉綠素a，發現加入菌劑Y1均能對銅綠微囊藻產生降解作用。隨著時間的增加降解率提高，在第6 d葉綠素a的量均為0。在此基礎上，研究不同菌藻比對發光細菌的毒性研究，以未加菌液的銅綠微囊藻為對比，在第3 d時，空白、1∶10、1∶5的相對放光度都降低了，而菌藻比1∶20的相對發光度上升了，到了第6 d，各溶液的相對發光度繼續減少，投菌量越多，對發光細菌的抑制作用越強，藻細胞經過Y1菌的降解毒性反而增強了?？赡艿脑蚴窃辶枯^少導致菌大量繁殖，而Y1菌為球形芽孢桿菌，球形芽孢桿菌能夠作為殺蚊劑，具有一定的毒性[23]。

2.2 初始藻液質量濃度對溶藻產物急性毒性影響

在初始葉綠素a濃度分別為34.92 mg/m3、46.56 mg/m3、58.2 mg/m3的藻液中投加1∶10的Y1菌液，由圖可知，Y1菌液對不同初始濃度的藻液均有降解效果。在第3 d分別降解至21.22 mg/m3、21.12 mg/m3、23.38 mg/m3，初始濃度高抑制效果更好，處理6 d后Y1菌均能將藻完全殺死。對于不同初始濃度的藻液進行發光細菌的毒性研究，從第1 d的數據可以看出，藻初始濃度越高對發光細菌的抑制能力越強。隨著未加菌樣葉綠素a濃度的提高，其相對發光度隨之降低，藻濃度越高，相對發光度越低。加入1∶10的Y1菌液后，濃度2和3的水樣相對發光度雖然降低，但與對照組相比，其對發光細菌的毒性并沒有那么強。菌液作用6 d后，處理組的相對發光度分別為71.75%、77.10%、69.47%，而對照組為80.02%，66.63%，66.47%。說明水樣中微量的藻毒性較小，而藻濃度較高時，水中的藻毒素的含量因藻的代謝和破裂比低濃度時更高[24]，Y1菌劑是溶藻和降解藻毒素的雙效工程菌，投加菌劑后既能溶解藻又將產生的藻毒素也降解了，能夠有效的降低水質的急性毒性。

2.3 BAF進出水源水健康風險評價

向其中一個BAF裝置中投加250 mL 1.87×105 cfu·mL-1的Y1菌液。以BAF裝置處理的進出水樣中MCLR質量濃度為基礎，運用式（2）計算出MCLR的長期攝入量并通過非致癌風險值計算式（1）計算出R值。通過BAF工藝處理過的水源水MCLR濃度都下降了。由測定的藻毒素含量可知未加菌的1號BAF進水MCLR濃度在2.89～4.75 μg/L之間，而加菌的2號BAF進水MCLR濃度在3.34～4.87 μg/L之間，1號出水濃度為156～3.33 μg/L，2號加菌處理后的濃度在0.72～3.37 μg/L。水樣中MCLR的R值為2.4 ～ 4.05，經過處理之后水樣的毒性均減小了，1號BAF工藝出水R值最低1.3，最高2.8，而加菌以后對MCLR的去除效率更高，R值為0.6 ～ 2.8。

通常認為R值>1對人的身體有害，R值≤1對人的身體危害較小[25]。通過上述計算可知處理前的水中MCLR的R值均>1，原水中MCLR含量超標嚴重影響人體健康，經過BAF處理后出水的R值明顯減小，但由于原水樣的MCLR濃度過高，處理后的水樣仍然損害人體，加菌處理的水樣處理效果比未加菌的樣好，處理完的水最低R值達到0.6，小于1，符合要求。

2.4 有機物致突變強度的預測模型

從3月28日至4月29日中選取8 d測定水溫和Y1菌強化后BAF裝置的進出水UV254數值。通過測得的數據可知，經過處理后水的UV254遠遠小于進水值。UV254數值能夠很好的確定水中大分子有機物的量，這些大分子包括一些能致癌的芳香族化合物。通過回歸方程計算得到不同UV254下的回復突變率MR。通常認為MR>2則有致突變性，而MR≤2即為無致突變性。未經處理的源水MR在2.24 ～ 3.06之間，均大于2具有致突變性，而經過處理后水的MR在0.46 ～ 0.85之間，遠遠小于2，基本清除致突變性。

3 結論

1）由于Y1菌為球形芽孢桿菌具有一定毒性，當藻濃度過低時加入Y1菌劑的毒性要比不加菌高。而藻濃度越高，對發光細菌毒性越大，加菌后葉綠素a濃度降低，對發光細菌的毒性也隨之降低，分析說明溶藻產物對發光細菌的毒性并不大。

2）健康分險評價模型分析表明，未經BAF處理過的水中MCLR的R值為2.4～4.05，對人體的傷害很大，處理過后的水R值明顯減少為1.3～2.8，加Y1菌的BAF出水MCLR的R值最低達到06，低于基準值，無健康風險。UV254與致突變強度的預測模型分析表明，處理前的水中有機物MR>2，具有致突變性，而經過處理的水MR遠小于2，基本無致突變性，說明Y1應用于水源水無生物毒性和致突變風險。

參考文獻：

[1] 周國鼎.藍藻污染的危害及防治[J].污染防治技術，2008，21（1）：8688.

ZHOU G D. Effect of cyanobacteria pollutionand control methods[J]. Pollution Control Technology， 2008，21（1）： 8688.（in Chinese）

[2] 陳建中，郭玲，湯玲燕，等.藍藻毒素影響植物生長發育及其機制研究進展[J].生態環境學報，2015，24（4）：724728.

CHEN J Z，GUO L， TANG L Y， et al. Advances and its mechanism in the effect of cyanobacterial toxins on plant growth [J]. Ecology and Environmental Sciences， 2015，24（4）：724728. （in Chinese）

[3] TAKUMI S， SHIMONO T， IKEMA S，et al. Overexpression of carboxylesterase contributes to the attenuation of cyanotoxin microcystinLR toxicity [J]. Comparative Biochemistry and Physiology，2017，194：2227.

[4] 黎雷，高乃云，殷娣娣，等.控制飲用水原水中藻類、藻毒素的水廠處理工藝[J].中國給水排水，2008，24（6）：2024.

LI L， GAO N Y， YIN D D， et al.Treatment processes in water works for removal of algae and algal toxins from raw water [J]. China Water&Wastewater;，2008，24（6）：2024.（in Chinese）

[5] 朱小奕，陳瑾，張建英.水環境中藻毒素生態風險的物種敏感性分布評價[J].生態毒理學報，2016， 11（3）：131139.

ZHU X Y，CHEN J，ZHANG J Y. Assessing ecological risk of cyanotoxins based on interspecies correlation estimation and species sensitivity distributions[J]. Asian Journal of Ecotoxicology，2016， 11（3）：131139.（in Chinese）

[6] 母銳敏，賈靜靜，張盛至.溶藻細菌FSl的溶藻效果與機制初探[J].微生物學雜志，2015，35（6）：1620.

MU R M， JIA J J， ZHANG S Z. Initial investigation on algicidal effect and mechanism of algaelytic bacteria FS1 [J]. Journal of Microbiology，2015，35（6）：1620.（in Chinese）

[7] ROTH P B， TWINER M J， MIKULSKI C M， et al. Comparative analysis of two algicidal bacteria active against the red tide dinoflagellate Karenia brevis[J].Harmful Algae，2008，7（5）： 682691.

[8] 孔赟，朱亮，徐向陽，等.溶藻菌發酵液及其溶藻產物的生物急性毒性試驗[J].生態環境學報，2012，21（5）： 913918.

KONG Y， ZHU L， XU X Y，et al. Acute toxicity of the fermentation broth of algaelying bacteria and its products[J]. Ecology and Environmental Sciences， 2012， 21（5）： 913918.（in Chinese）

[9] 張述偉，孔祥峰，姜源慶，等.生物監測技術在水環境中的應用及研究[J].環境保護科學，2015，41（5）：103107.

ZHANG S W， KONG X F， JIANG Y Q， et al. Review of application and research of biological monitoring technologies in aquatic environment [J]. Environmental Protection Science，2015，41（5）：103107.（in Chinese）

[10] 黃燦克，劉婷婷，湯曉畏.發光細菌毒性法在飲用水水質評估與預警中的應用[J].環境監控與預警，2015，7（3）： 47.

HUANG C K， LIU T T， TANG X W. Application of the photobacteria toxicity detection method in water quality assessment[J]. Environmental Monitoring and Forewarning and Early Warning of Drinking Water， 2015，7（3）： 47.（in Chinese）

[11] GIROTTI S，FERRI E N，FUMO M G， et a1.Monitoring of environmental pollutants by bioluminescent bacteria [J].Analytica Chimica Acta，2008，608（1）：229.

[12] 倪彬，王洪波，李旭東，等.湖泊飲用水源地水環境健康風險評價[J].環境科學研究，2010，23（1）：7479.

NI B， WANG H B， LI X D， et al. Water environmental health risk assessment in lake sources of drinking water[J]. Research of Environmental Sciences，2010，23（1）： 7479.（in Chinese）

[13] 季文佳，楊子良，王琪，等. 危險廢物填埋處置的地下水環境健康風險評價[J].中國環境科學， 2010，30（4）： 548552.

JI W J， YANG Z L， WANG Q， et al. Health risk assessment of groundwater in hazardous waste landfill disposal[J]. China Environmental Science， 2010，30（4）： 548552.（in Chinese）

[14] 王偉琴，金永堂，吳斌，等.水源水中微囊藻毒素的遺傳毒性與健康風險評價[J].中國環境科學，2010，30（4）： 468476.

WANG W Q， JIN Y T， WU B， et al. Assessment on genotoxicity and health risks of microcystin in drinking water sources [J]. China Environmental Science， 2010， 30（4）：468476.（in Chinese）

[15] ENVIRONMENT PROTECTION AGENCY U S. Risk assessment guidance for superfund volume I human health evaluation manual （part A）[R]. Washington DC： Office of Emergency and Remedial Response， 1989： 17.

[16] 楊彥，于云江，魏偉偉，等.常州市淺層地下水重金屬污染對城區、城郊居民健康風險評價[J].環境化學，2013，32（2）：201211.

YANG Y， YU Y J， WEI W W， et al. Health risk assessment of heavy metals in shallow groundwater in urban and suburban areas of Changzhou[J]. Environmental Chemistry，2013，32（2）：201211.（in Chinese）

[17] 國家環境保護總局《水和廢水監測分析方法》編委會.水和廢水監測分析方法[M].4版.北京：中國環境科學出版社，2002：250253.

State Environmental Protection Administration "Water and Wastewater Monitoring and Analysis Methods" Editorial Board. Water and wastewater monitoring and analysis methods [M].4th Edition.Beijing： China Environmental Science Press，2002：250253.（in Chinese）

[18] 孟元華，朱鵬飛，龔燕，等.太湖水產品中微囊藻毒素RR的污染狀況及初步健康風險評估[J].食品安全質量檢測學報，2016，7（5）：17941797.

MENG Y H， ZHU P F， GONG Y， et al. Pollution status and preliminary health risk assessment of microcystin—RR in aquatic products of Taihu lake[J]. Journal of Food Safety and Quality，2016，7（5）：17941797.（in Chinese）

[19] EPA U.S.Superfund public health evaluation manual[R].EPA/ 540/186060， 1986.

[20] REZAITABAR S， SARI A E， BAHRAMIFAR N， et al. Transfer， tissue distribution and bioaccumulation of microcystin LR in the phytoplanktivorous and carnivorous fish in Anzali wetland， with potential health risks to humans[J]. Science of The Total Environment，2017，575：11301138.

[21] USEPA. Guidelines for Carcinogen Risk Assessment[S]. Washington DC： 2005.

[22] 金濤.江蘇某地長江、太湖水源飲用水中有機物的致突變性、雌激素活性及其健康風險評價[D].武漢：華中科技大學，2013.

JIN T. The mutagenic and the estrogenic activity of organic compounds and health risk assessment in source water and finished water from the Yangtze River and Taihu Lake in Jiangsu Province [D].Wuhan：Huazhong University of Science and Technology，2013. （in Chinese）

[23] 李新社，曾建德，陸步詩，等.球形芽孢桿菌對酒曲害蟲黑菌蟲的毒殺效果 [J].農藥，2008，47（3）：217218.

LI X S， ZENG J D， LU B S， et al. Insecticidal effectivity of bacillus sphaericus to main daqu insect alphitobius diaperinus panzer[J]. Agrochemicals， 2008，47（3）： 217218.（in Chinese）

[24] PATRICK O I. Oxidative stress biomarkers in clarias gariepinus （Burchel， 1822） exposed to MicrocystinLR [J]. BeniSuef University Journal of Basic and Applied Sciences，2017，6（1）：6975.

[25] 張明，唐訪良，徐建芬，等.杭州貼沙河微囊藻毒素污染特征及健康風險評價[J].環境監測管理與技術，2016，28（1）：2731.

ZHANG M， TANG F L， XU J F， et al. Characteristics and health risk assessment of microcystins polution in Tiesha River[J]. Environmental Monitoring Management and Technology，2016，28（1）：2731.（in Chinese）

（編輯 胡玲）