響應曲面法優化魚腥草多糖提取工藝及抗氧化活性測定

潘巧靈，姜 波*，于 靜，冉乾鴻，李歡歡

（大連民族大學生命科學學院 116600）

近年來，中醫藥行業越發引起人們的關注，而壯藥等民族醫藥更是因其特有的民族色彩而為人們所關注。魚腥草，學名蕺菜，又名折耳根，多生長于廣西等中國西南部地區，因其氣味略帶腥臭，故名魚腥草。屬胡椒目三白草科蕺菜屬，常用的魚腥草為蕺菜的地上干燥部分。性寒涼，歸肺經，具有清熱解毒、除濕利尿等作用，用于熱毒、濕邪、疾熱為患的肺癰等癥。經研究表明，魚腥草中含有黃酮類、甾醇類、生物堿、維生素、有機酸、水溶性多糖等多種物質，是極具開發潛力的植物資源[1-3]。但目前人們在生活中接觸到魚腥草的主要方式，還是采用直接食用或顆粒飲用等方式，魚腥草成分提取的相關產品較少，本文旨在對魚腥草水溶性粗多糖的提取工藝進行研究，以尋找最優提取方案，同時對多糖的抗氧化活性進行了測定。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

魚腥草（購買于廣西南寧市藥房，原產于廣西），乙醇（95%），葡萄糖、苯酚、濃硫酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、番紅花紅、EDTA-Na2、硫酸亞鐵、H2O2、抗壞血酸（Vc）、1,1-二苯基苦基苯肼（DPPH）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、鄰苯三酚、濃鹽酸，以上試劑均為分析純。

高速萬能粉碎機，天津市泰斯特儀器有限公司；電子分析天平，上海奧豪斯公司；儀表恒溫水浴鍋，金北德工貿有限公司；離心機，上海安亭科學儀器制造廠；電熱恒溫鼓風干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司；循環式多用真空泵，鄭州長城儀廠；超聲清洗設備，大連開發區博信超聲設備有限公司；UV2201型紫外-可見分光光度計，日本島津公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 魚腥草多糖提取。將干燥魚腥草用高速萬能粉碎機粉碎，80目過篩，精確稱取2.00g魚腥草固體粉末，一定液料比加水浸泡，恒溫水浴浸出，抽濾去渣取濾液，旋轉蒸發濃縮濾液，加入5倍體積的95%乙醇，4℃冰箱靜置24h，多糖沉淀，以4000r/min離心15min，并用無水乙醇洗滌，取沉淀蒸干得水溶性多糖，研磨待用[4]。

1.2.2 葡萄糖標準曲線的測定。稱取葡萄糖0.1g加入至100mL容量瓶并用蒸餾水定容，制得1.0mg/mL葡萄糖標準溶液。取 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL 配制好的葡萄糖標準溶液于100mL容量瓶中，去離子水定容，制得 10、20、30、40、50μg/mL 葡萄糖標準溶液。分別取上述配制的各濃度的葡萄糖溶液1mL于試管中，加入1mL 6%苯酚溶液，加入5mL濃硫酸，搖勻，靜置30min，以蒸餾水做空白管，在488nm波長下測定標液的吸光值[5,6]。

1.2.3 魚腥草多糖含量測定。分別取0.05g按步驟1.2.1所制得的魚腥草水溶性粗多糖于50mL容量瓶中，去離子水定容，各取5mL配制的多糖溶液稀釋至50mL容量瓶中，得到多糖稀釋液。將所得的多糖稀釋液同樣以1.2.2中的苯酚——硫酸法測定其多糖含量，以蒸餾水代替糖溶液反應作為空白管。通過所測得的吸光度值與測定的葡萄糖標準曲線，可求得樣品濃度，再通過以下兩式計算可求出樣品多糖含量與多糖得率[7]。

1.2.4 響應曲面設計。采用Box－Behnken試驗方法對試驗的提取溫度、提取時間、料液比進行三因素三水平試驗設計，試驗條件見表1因素水平表。

表1 響應曲面因素水平表

1.2.5 魚腥草多糖抗氧化活性測定。①對OH-清除率測定：利用Fenton體系，在每支試管分別加入1.5mL 0.15mol/L的磷酸緩沖溶液、0.2mL 260μg/mL番紅花紅溶液、0.7mL 2mmol/mL EDTA-Na2-Fe2溶液，再分別加入各級濃度多糖濃度試樣1.0mL、0.8mL 3%H2O2溶液，混勻后37℃水浴保溫30min，以蒸餾水做空白管，3%H2O2代替試樣與EDTA-Na2-Fe2+溶液做對照管，在510nm波長下測定吸光度（A）。平行測定3次，取平均值，并與同濃度Vc清除率做對比。清除率計算公式為：清除率（%）=（A試樣-A空白）/（A對照-A空白）×100。②對O2-清除率測定：取4.5mL 0.05mol/L pH-8.25的Tris-HCl緩沖液于試管中，于25℃水浴鍋中預熱25min，分別加入1mL不同濃度的多糖稀釋液，0.4mL 3mmol/L鄰苯三酚水溶液，以Tris-HCl為空白管，混勻于25℃精確反應4min，立即用0.5mL濃鹽酸終止反應，在最大波長299nm下測吸光度。平行測定3次，取平均值，并與同濃度Vc清除率做對比。清除率計算公式為：清除率（%）=（1-A試樣/A空白）×100。③對 DPPH清除率測定：2mL各級濃度多糖溶液分別加入2mL 0.16mmol/L的DPPH溶液，于25℃恒溫反應15min，在波長525nm下測定吸光度[8]。平行測定3次，取平均值，并與同濃度Vc清除率做對比。清除率計算公式為：清除率（%）=（1-A試樣/A空白）×100。

2 結果與討論

2.1 葡萄糖標準曲線

在試驗條件下，以葡萄糖濃度單位為橫坐標、吸光度為縱坐標繪制葡萄糖標準曲線，求得葡萄糖標準曲線方程 為 y=0.0101x+0.0034，R2=0.9969，線性關系較好，結果如圖1所示。

圖1 葡萄糖標準曲線

2.2 響應面試驗結果

表2 響應面試驗條件及結果

根據響應面法設計三因素三水平試驗，對計算出的試驗條件按步驟1.2.1進行多糖提取試驗，求得相應條件下的多糖提取率，以Design expert8.0.6.1版軟件對所得試驗結果進行分析，所得結果見表2。

在試驗結果的基礎上以A（提取溫度）、B（提取時間）、C（液料比）為自變量，Y（提取率）為響應值，求得多糖提取率對三因子的擬合回歸方程為R1=5.18+0.15A-0.043B+0.22C-0.11AB+0.067AC-0.015 BC-0.45A^2-0.24B^2-0.52C^2，R2=0.9586。試驗結果見表3。

表3 響應面分析結果

由表3可得知，該模型P值為0.0012，該模型差異極顯著（p＜0.01）。R2=0.9586，說明有約95.86%的魚腥草多糖提取率變化符合該模型，模型擬合程度較好，試驗誤差較小，該試驗模型成立。由各因素F值可知，三因素對魚腥草多糖提取的影響顯著性排序為：C（液料比）＞A（提取溫度）＞B（提取時間）[9]，A、B 與C 之間的交互作用不顯著（P＞0.05），這表明魚腥草多糖與各個因子之間不單單是線性關系；失擬項P=0.0634＞0.05表明失擬不顯著，一定程度上說明模型擬合程度好，因此該模型可以對提取的多糖的ORAC值進行預測和分析。

由相關因素的3D響應面圖及等高線圖結合可看出，液料比對魚腥草多糖提取工藝的影響極大，在適宜液料比下提取率較高，而當液料比過高時多糖提取率下降明顯。AC之間的交互作用最顯著，AB次之，BC之間交互作用最不顯著。由軟件求得的最佳實驗結果為提取溫度為81℃，提取時間為1.86h，料液比為32mL/g，提取率為5.22%，為驗證試驗準確性，按最佳試驗結果重復進行3次試驗，得到魚腥草多糖提取率為5.07%，試驗結果較好，該試驗方案可行[10]。

圖3 三因素對多糖得率影響的響應面圖及等高線圖

2.3 多糖抗氧化活性能力測定結果

2.3.1 對OH-清除率測定。通過在波長510nm下測定得到的吸光度及相關計算，得到魚腥草多糖及同濃度Vc對羥基自由基的清除率。由圖4可以看出，魚腥草多糖對羥基自由基的清除率，與Vc清除能力對比較差，但隨著多糖濃度的升高，其清除率也有著較為明顯的提升。當多糖濃度達到10.15μg/mL時，對羥基自由基的清除率高達11.46%[11]。

圖4 魚腥草多糖及同濃度Vc對-OH清除率比較

2.3.2 對O2-清除率測定結果及Vc對比。通過在波長299nm下測定得到的吸光度及相關計算，得到魚腥草多糖及同濃度Vc對O2-的清除率。由圖5可看出，魚腥草多糖溶液對O2-清除率對比同濃度Vc的清除率較低，且隨著多糖濃度的增長，清除率提升幅度不大。

圖5 魚腥草多糖及同濃度Vc對O2-清除率比較

2.3.3 對DPPH清除率測定結果及Vc對比。通過在波長525nm下測定得到的吸光度及相關計算，得到魚腥草多糖及同濃度Vc對DPPH的清除率。由圖6可看出，魚腥草多糖對DPPH的清除率，比同濃度Vc對DPPH清除率較低，但清除率強弱差距較小，且兩者清除率曲線斜率相近，說明清除能力的線性關系相近，都隨著濃度的增加而提升，說明魚腥草多糖對DPPH的清除力較好。當多糖濃度達到10.15μg/mL時，對DPPH的清除率達到了66.31%。

圖6 魚腥草多糖及同濃度Vc對DPPH清除率比較

3 結論

通過響應面優化的方法對魚腥草多糖提取工藝進行優化，對提取溫度、提取時間、液料比進行試驗，得出魚腥草多糖提取的最優工藝參數為提取溫度為81℃，提取時間為1.86h，料液比為32mL/g，魚腥草多糖得率為5.22%，在此基礎之上進行3次重復試驗，得到平均提取率為5.07%，試驗誤差較小，說明試驗方案可行性較高。通過測定魚腥草多糖溶液對3種自由基離子的清除率，以及對同濃度Vc清除率的對比，對比兩者抗氧化能力強弱。由清除率圖表可知，魚腥草多糖抗氧化活性對比同濃度Vc相對較弱，但其對DPPH清除能力較好，對羥基自由基離子及超氧根離子也具有一定的清除能力。

（收稿：2018-05-26）