大腸埃希菌外膜囊泡遞呈豬瘟病毒E2蛋白的表達及其免疫效果評價

黃 杰，龔永平，文繼峰，楊 銳，任 露，顏其貴，，*

(1.四川農業大學 動物醫學院，四川 成都 611130；2.四川農業大學 動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，四川 成都 611130)

豬瘟(classical swine fever，CSF)是由豬瘟病毒(classical swine fever virus，CSFV)引起的一種高度接觸性傳染病，被世界動物衛生組織(OIE)列為A類傳染病，我國列為一類傳染病，可造成養豬業的巨大損失[1-3]。CSFV是黃病毒科(Flaviviridae)瘟病毒屬(Pestivirus)的成員，為有囊膜的單股正鏈RNA病毒[4]，該病毒的E2蛋白是一種囊膜糖蛋白，是CSFV誘導被感染動物機體產生主要免疫保護性的抗原蛋白[5]，在病毒吸附和入侵宿主細胞中起主要作用，所以常用作疫苗研究和免疫診斷等方面的目標蛋白[6]。

外膜囊泡(outer membrane vesicles，OMVs)是革蘭氏陰性菌和部分革蘭氏陽性菌以出芽方式分泌的一種球形、雙層膜狀結構分泌小泡，與所分泌細菌的外膜成分相同，包括脂多糖、外膜蛋白、磷脂等，還包裹有部分周質甚至DNA，形成直徑為20～250 nm的顆粒[7-8]。OMVs具備適于被免疫細胞識別的特征，可作為外源大分子抗原的遞呈載體[9]。由于OMVs不能復制且含有大量的細菌抗原，具有免疫佐劑效果，并能有效激活免疫系統，因而被認為是極具潛力的候選疫苗或者疫苗載體。在歐洲，腦膜炎奈瑟菌(Neisseriameningitidis)B群OMVs疫苗已經上市，該疫苗的使用大規模地降低了B群奈瑟腦膜炎發病率[10]。此外，OMVs也可作為其他傳染性疾病的預防用疫苗[11-12]。

細胞溶素A(cytolysin A，ClyA)是一種細菌外膜上的成孔蛋白，將目的蛋白的核酸序列融合在ClyA基因序列的C-端后，融合的外源蛋白被定位在菌體及其所分泌的OMVs的外膜上，且外源蛋白暴露于囊泡外部，同時起到富集外源蛋白的作用[13-15]。本研究利用基因重組技術，將切除跨膜區后的CSFVE2基因序列連接在ClyA的C-端，通過大腸埃希菌原核表達出含ClyA-E2融合蛋白的OMVs，成功地將E2蛋白融合呈現在OMVs表面，對ClyA-E2 OMVs進行兔體免疫效果評價，為新型CSFV疫苗研究提供思路和基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑

pMD19-T Vector和E.coliDH5α感受態細胞購自TaKaRa公司；表達質粒pBAD18-Cm-ClyA由四川農業大學豬病研究中心曹三杰教授惠贈；包含CSFVE2片段(含跨膜區)的pUC57質粒和CSFV E2蛋白由本實驗室提供；Solution Ⅰ購自TaKaRa公司；膠回收試劑盒和質粒小量提取試劑盒均購自OMEGA公司；組氨酸標簽單抗和山羊抗鼠HRP-IgG酶標二抗及ECL顯色液購自生工生物工程(上海)股份有限公司；豬瘟兔化弱毒疫苗(C株)由四川華神獸用生物制品有限公司提供。

1.1.2 實驗動物

實驗動物為平均體質量約1 kg的清潔級新西蘭大白兔雌兔，購自成都達碩實驗動物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設計

以CSFVE2基因的pUC57質粒為模板，設計引物：上游5′-TCTAGAATGCGTCTGGCCTGT-3′(單下劃線部分為XbaⅠ酶切位點)，下游5′-CTACTTCGAAGATTACCACTACCACTACTACAAA TTCTGCAAAATAATCGCT-3′(單下劃線部分為HindⅢ酶切位點，虛線為終止密碼子，雙下劃線部分為6個組氨酸的標簽序列)，PCR擴增出去除E2蛋白跨膜區后的序列及其C-端引入的6個組氨酸的標簽序列基因片段，預期擴增長度為1 056 bp。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.2 E2-His DNA片段的擴增與克隆

以含CSFVE2基因的pUC57質粒為模板進行PCR擴增，反應程序：98 ℃預變性3 min；98 ℃變性10 s，58 ℃退火10 s，72 ℃延伸1 min，35個循環；72 ℃延伸5 min。1%瓊脂糖電泳檢測PCR產物，并回收目的片段。

將回收的E2-His片段與pMD19-T Vector連接，轉化E.coliDH5α。用質粒小量提取試劑盒提取pMD19-T-E2-His進行單雙酶切鑒定，并送生工生物測序。

1.2.3 pBAD18-Cm-ClyA-E2-His原核表達質粒的構建及鑒定

用限制性核酸內切酶XbaⅠ和HindⅢ雙酶切pMD19-T-E2-His質粒DNA，1%瓊脂糖凝膠回收目的片段，同法酶切pBAD18-Cm-ClyA質粒DNA，回收大片段，將目的片段和大片段用SolutionⅠ進行連接，置16 ℃連接10 h，轉化E.coliDH5α感受態細胞，用氯霉素抗性的LB固體培養基篩選，獲得含pBAD18-Cm-ClyA-E2-His質粒的重組菌。抽提質粒進行單雙酶切鑒定，并送生工生物測序。

1.2.4 重組OMVs的誘導表達、制備與定量

將含重組表達質粒pBAD18-ClyA-E2-His的E.coliDH5α培養至D600為0.5～0.6時，加入終濃度為0.2%阿拉伯糖于30 ℃、160 r·min-1振蕩培養20 h進行誘導表達；表達菌液于4 ℃、12 000g離心去除菌體，收集上清液；通過0.45 μL孔徑濾膜過濾、100 ku超濾濃縮和超高速離心(4 ℃，125 000g，4 h)處理后，取沉淀溶于200～300 μL PBS液中，即為重組OMVs。將重組OMVs送武漢谷歌生物科技有限公司進行透射電鏡觀察重組OMVs囊泡。使用BCA蛋白定量試劑盒(BestBio)對重組OMVs進行總蛋白質定量，操作按照試劑盒說明書進行。經定量的重組OMVs于-80 ℃保存備用。

1.2.5 重組OMVs的蛋白酶K與EDTA處理及Western blot分析

取3份重組OMVs，分別經蛋白酶K(終濃度為0.1 mg·mL-1)、EDTA(終濃度為0.1 mol·mL-1)、蛋白酶K和EDTA(終濃度同前)37 ℃處理過夜。以含重組OMVs未經蛋白酶K與EDTA處理的表達菌做對照，將經過處理的重組OMVs樣品經10% SDS-PAGE電泳；以25 V、25 min半干轉移至硝酸纖維素膜上，用含5%脫脂奶粉封閉液封閉1.5 h；加入His標簽單克隆抗體(1∶5 000)，4 ℃孵育過夜；TBST洗膜3次，每次5 min，加入二抗HRP-IgG(1∶5 000)，常溫孵育1.5 h；TBST洗膜3次，每次5 min，加入ECL底物顯色液進行顯色并曝光拍照。

1.2.6 重組OMVs兔體免疫試驗

選取經ELISA方法檢測為豬瘟抗體呈陰性的16只平均質量為1 kg的健康新西蘭大白兔雌兔，將其隨機分為A、B、C、D 4個組，A、B、C組各4只，D組3只。隔離條件下飼養一周后，A組用重組OMV免疫(500 μg·只-1)，以PBS稀釋；B組用豬瘟兔化弱毒疫苗免疫對照(1 頭份·只-1)，以疫苗稀釋液稀釋；C組用E2蛋白免疫對照(500 μg·只-1)，以完全和不完全弗氏佐劑乳化；D組用PBS注射作為空白對照(2 mL·只-1)。免疫方式為皮下多點注射，每2周免疫一次，共免疫3次。

1.2.7 間接ELISA檢測血清抗體水平

在每次免疫一周后進行耳靜脈采血，分離血清。通過間接ELISA方法測定血清抗體效價。以2 μg·mL-1的CSFV E2蛋白包被酶標板，包被量為100 μL·孔-1，4 ℃包被12 h，然后用200 μL TBST緩沖液(含5% BSA)封閉1.5 h；加300 μL·孔-1緩沖液TBST洗滌，洗滌3次，每次5 min；加100 μL經1∶200稀釋后的免疫血清，37 ℃孵育1.5 h；加300 μL·孔-1TBST緩沖液洗滌，洗滌3次，每次5 min；加入按1∶6 000稀釋的HRP標記的山羊抗兔IgG二抗(100 μL·孔-1)，37 ℃孵育1 h；加入ECL底物100 μL·孔-1，避光顯色10 min；加入2 mol·L-1硫酸溶液100 μL·孔-1，終止反應并測定D450值。D450值≥0.328判為陽性，D450值≤0.271判為陰性，二者之間為可疑值，需重新測定。

1.2.8 兔體攻毒保護試驗

三免后2周進行攻毒試驗，每只兔子耳緣靜脈注射50頭份的豬瘟兔化弱毒疫苗，攻毒后每6 h測一次體溫，共測96 h，并評定各免疫組在免疫保護方面的差異性。

2 結果與分析

2.1 E2-His DNA片段的PCR擴增及電泳鑒定

以含CSFVE2基因的pUC57質粒為模板進行PCR擴增后，1%瓊脂糖凝膠電泳檢查，結果顯示在約1 056 bp處有一條帶，與預期大小符合，如圖1所示。

2.2 克隆質粒pMD19-T-E2-His的鑒定

用限制性內切酶XbaⅠ和HindⅢ對質粒pMD19-T-E2-His進行單酶切和雙酶切，然后用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，在相應泳道上均出現與預期大小相符的目的條帶，如圖2所示。序列測定分析顯示，重組片段無任何堿基突變，表明重組質粒構建成功。

2.3 原核表達質粒pBAD18-Cm-ClyA-E2-His的鑒定

用限制性內切酶XbaⅠ和HindⅢ對質粒pBAD18-Cm-ClyA-E2-His進行單酶切和雙酶切，然后用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，在相應泳道上均出現與預期大小相符的目的條帶，如圖3所示。序列測定分析顯示，重組片段無任何堿基突變，表明重組質粒構建成功。

M，DL2000 DNA marker；1，E2-His DNA片段；2，陰性對照。M， DL2000 DNA marker; 1， E2-His DNA fragment; 2， Negative control.圖1 E2-His DNA片段的PCR擴增結果Fig.1 E2-His DNA fragment amplified by PCR

M，DL10 000 DNA marker；1，pMD19-T-E2-His質粒的XbaⅠ單酶切；2，pMD19-T-E2-His質粒的XbaⅠ和HindⅢ雙酶切。M， DL10 000 DNA marker; 1， Single digestion of pMD19-T-E2-His plasmid with XbaⅠ; 2， Double digestion of pMD19-T-E2-His plasmid with XbaⅠ and HindⅢ.圖2 克隆質粒pMD19-T-E2-His的酶切結果Fig.2 Results of restriction enzyme of clone plasmid of pMD19-T-E2-His

M，DL10 000 DNA marker；1，pBAD18-ClyA-E2-His質粒的XbaⅠ單酶切；2，pBAD18-ClyA-E2-His質粒的XbaⅠ和HindⅢ雙酶切。M， DL10 000 DNA marker; 1， Single digestion of pBAD18-ClyA-E2-His plasmid with XbaⅠ; 2， Double digestion of pBAD18-ClyA-E2-His plasmid with XbaⅠ and HindⅢ.圖3 原核表達質粒pBAD18-ClyA-E2-His的酶切結果Fig.3 Results of restriction enzyme of prokaryotic expression plasmid of pBAD18-ClyA-E2-His

2.4 重組蛋白在OMVs上的表達

經SDS-PAGE顯示，含重組表達質粒pBAD18-Cm-ClyA-E2-His的大腸埃希菌經過0.2%阿拉伯糖誘導后與空載菌相比較，約在72 ku處出現了目的條帶。同樣地，含重組蛋白的OMVs與空OMVs相比較，約在72 ku處出現了一條目的條帶(圖4)。

2.5 重組蛋白Western blot分析

Western blot分析顯示，2%阿拉伯糖誘導的重組菌和含重組蛋白的OMVs在約72 ku處出現了特異性的目的條帶，而2%阿拉伯糖誘導的空載菌和空OMVs則沒有。同時，為了驗證重組蛋白遞呈在OMVs的外表面，將重組OMVs分別或同時用蛋白酶K和EDTA處理。Western blot結果顯示，分別用蛋白酶K、蛋白酶K/EDTA處理后的重組OMVs沒有出現任何條帶，而EDTA處理后出現了目的條帶，如圖5所示。

M，預染蛋白質marker；1，0.2%阿拉伯糖誘導后的重組菌；2，0.2%阿拉伯糖誘導后的空載菌；3，重組OMVs；4，空OMVs。M， Pre-stained protein marker; 1， Recombinant bacteria induced with 0.2% arabinose; 2， Empty bacteria induced with 0.2% arabinose; 3， Recombinant OMVs; 4， Empty OMVs.圖4 重組蛋白的表達Fig.4 Expression of recombinant protein

2.6 呈遞E2蛋白的重組OMVs的透射電鏡觀察

呈遞E2蛋白的重組OMVs通過透射電鏡觀察可見大小20～250 nm的圓形膜狀結構(圖6)。

2.7 間接ELISA檢測免疫家兔血清抗體水平

對每次免疫7 d后的家兔進行耳緣靜脈采血，分離血清進行間接ELISA方法檢測。結果顯示，重組OMVs組首免后7 d，抗體水平與豬瘟疫苗組和E2蛋白質組差異都不明顯(P>0.05)；二免后7 d，三組抗體水平均迅速上升，重組OMVs組低于豬瘟疫苗組(P>0.05)，比E2蛋白質組高，差異顯著(P<0.05)；三免后7 d，重組OMVs組抗體水平略低于豬瘟疫苗組(P>0.05)，高于E2蛋白質組(P<0.05)。結果表明，OMVs-E2比豬瘟弱毒疫苗和E2蛋白質更快速地刺激并誘導機體產生免疫應答，比E2蛋白質更能刺激機體產生高水平的抗體(表1)。

M，預染蛋白質marker；1，0.2%阿拉伯糖誘導后的重組菌；2，0.2%阿拉伯糖誘導后的空載菌；3，重組OMVs；4，空OMVs；5，蛋白酶K處理的重組OMVs；6，EDTA處理的重組OMVs；7，蛋白酶K和EDTA同時處理的重組OMVs。M， Pre-stained protein marker; 1， Recombinant bacteria induced with 0.2% arabinose; 2， Empty bacteria induced with 0.2% arabinose; 3， Recombinant OMVs; 4， Empty OMVs; 5， Recombinant OMVs dealt with proteinase K; 6， Recombinant OMVs dealt with EDTA; 7， Recombinant OMVs dealt with proteinase K and EDTA simultaneously.圖5 重組蛋白的Western blot分析結果Fig.5 Western blot analysis of recombinant protein

圖6 呈遞重組蛋白的重組OMVs的透射電鏡觀察Fig.6 Transmission electron microscopy of recombinant outer envelope vesicles presented of recombinant protein

2.8 兔體免疫保護效果評價

用兔化CSFV C株攻毒前一天，各組兔體的體溫均在正常范圍內(39.0～39.5 ℃)。PBS組兩只實驗兔在攻毒24 h后體溫開始上升，均先后出現定型熱反應，在48 h后體溫最高的達41 ℃，以后逐漸下降至72 h恢復到正常體溫。豬瘟兔化弱毒疫苗組、重組OMVs組和E2蛋白質組在36 h后出現輕熱反應，但很快恢復正常體溫(圖7)，說明OMVs呈遞的E2蛋白能產生很好的保護效果。

表1重組OMVs免疫家兔不同時間后血清中特異性抗體水平

Table1Specific antibody level in rabbit serum detected by recombinant OMVs

組別Group免疫后不同時間兔體血清抗體水平Antibody level at different time after immunization in rabbit serum一免前7天7 days before thefirst immunization一免后第7天7 days after thefirst immunization二免后第7天7 days after thesecond immunization三免后第7天7 days after thethird immunization重組OMVs組Recombinant OMVs group0.139±0.0680.454±0.0630.949±0.1021.140±0.132豬瘟疫苗組Classical swine fever vaccine group0.157±0.0780.336±0.0081.042±0.0681.239±0.098E2蛋白質組E2 protein group0.162±0.0620.384±0.0360.767±0.0901.068±0.047PBS組PBS group0.175±0.0400.154±0.0090.192±0.0430.190±0.033

圖7 兔體溫變化曲線Fig.7 Rabbit body temperature curve

3 討論

CSFV E2蛋白屬于真核表達蛋白，利用原核表達系統表達的E2蛋白多為包涵體且表達量較少。本實驗以包含按照大腸埃希菌密碼子偏嗜性進行密碼子優化后的E2基因的pUC57質粒為模板(本實驗室保存)，設計引物，利用PCR成功擴增了去除E2蛋白跨膜區后的DNA片段，并在其C-端引入了編碼6個His的堿基序列(TACCACTACCACTACTAC)。通過構建的表達質粒獲得了含去除跨膜區后的E2蛋白的重組OMVs。Western blot結果證明，重組蛋白和重組OMVs能特異地與His標簽單抗結合，而經過蛋白酶K處理后的重組OMVs不能與His標簽單抗結合，鑒于蛋白酶K只能破壞OMVs外表面的蛋白，而EDTA只能破壞OMVs的膜結構，說明重組E2蛋白遞呈在OMVs的外表面[16]。同時，重組OMVs免疫印跡和SDS-PAGE條帶較細，說明OMVs上遞呈的E2蛋白量較全菌表達的量少。

兔體免疫試驗表明，一免后重組OMVs比E2蛋白組和豬瘟疫苗能更快更強地刺激機體產生特異性抗體；二免后重組OMVs組上升較豬瘟疫苗組慢，比E2蛋白組快；但在三免后重組OMVs組和豬瘟疫苗組抗體上升較E2蛋白組慢，可能因為兔體內高水平的抗體干擾所導致。為了分析其免疫保護效果，在兔體上進行了免疫攻毒試驗。CSFV弱毒C株是在家兔上反復傳代致弱而得到的，對豬只有良好的安全性和免疫效力，但對家兔有一定的致病性，可以使其產生定型熱反應[17]。本實驗用家兔作為動物模型評價重組OMVs的免疫效果[18-19]，發現兔體注射高劑量CSFV弱毒株C株后，PBS組的兔子出現明顯的定型熱反應，而重組OMVs組的兔體溫只在攻毒后24 h出現輕微的熱反應，但在12 h后恢復正常。綜上，大腸埃希菌OMVs具有很好的免疫佐劑效應，為研究大腸埃希菌分泌的OMVs作為病毒性蛋白遞呈載體提供了一定的理論依據，這將為CSF新型亞單位疫苗的研究提供新的思路和方向。