賽黑樺組織培養技術研究

蔣祥娥 西川浩已

摘 要： 以賽黑樺休眠枝萌發的腋芽為外植體，研究了不同種類和不同濃度植物激素對賽黑樺外植體誘導、愈傷組織誘導、不定芽增殖和生根等環節的影響。結果表明：①外植體芽的誘導培養以WPM +6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1為最佳培養基； ②愈傷組織誘導以WPM+6-BA1.0 mg·L-1+NAA 0.02 mg·L-1為最佳培養基；③在芽增殖培養中以WPM+6-BA0.1 mg·L-1+NAA 0.02 mg·L-1增殖效果最好，增殖系數達4.0；④生根培養以WPM+NAA0.05 mg·L-1效果最佳，生根率91.7%；⑤生根苗移栽成活率達90%以上。

關鍵詞： 中圖分類號：S792.189 文獻標識碼：A 文章編號：1004-3020（2018）04-0006-04

Abstract： The axillary buds sprouting from dormant shoots were used as explants to study the effects of plant hormones on explant induction， callus induction， adventitious proliferation and rooting. Results showed that： ①The medium of WPM+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1was the best initiation culture medium： ②The medium of WPM+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.02 mg·L-1 was the best callus induction medium. ③The medium of WPM+6-BA 0.1 mg·L-1+ NAA0.02 mg·L-1 with propagation coefficient 4.0 was the best proliferation culture medium. ④The medium of WPM+NAA 0.05 mg·L-1 with rooting rate 91.7% was the best rooting culture medium. ⑤The survival rate of transplants was higher than 90%.

Key words： Betula schmidtii； tissue culture； regeneration

賽黑樺（Betula schmidtii）為樺木科（Betulaceae）樺木屬（Betula）的落葉喬木樹種，又名遼東樺、鐵樺木、赤榆，主要分布在中國東北部、日本本州中部以北，朝鮮、俄羅斯等地方。其生長緩慢，材質致密，厚重堅硬，被稱為“比鋼鐵還要硬的樹”（世界之最：植物分冊），力學強度大，氣干密度為0.835～0.996 g·cm-3，適合做家具、地板及諸多特殊構件及特殊工藝產品（鐵樺樹樹種與資源分布的考證）。目前有關賽黑樺的研究以分類學為主，涉及的內容多是對賽黑樺與屬內其他種間親緣關系的探討（樺樹ISSR—PCR反應體系的優化、Discussions OU taxonomy of genus Betula in northeast China、利用RAPD標記技術對樺樹種間親緣關系的分析、Phylogenetic relationships of Betula species（Betulaceae）based on nuclear ADH and chloroplast matK sequences、Chemical evaluation of Betula species in Japan），其次是其木材構造及物理力學性質方面的研究（賽黑樺的構造特征和物理力學性質）。有關賽黑樺生長、良種選育、繁殖及其與環境關系的系統研究應是今后研究的主要方向，本文首次揭示了植物激素對賽黑樺組織培養效果的影響，以期為賽黑樺的良種無性繁殖做些基礎工作。

1 材料與方法

1.1 材料的處理

供試品種為日本山梨縣賽黑樺優良無性系，剪取長有飽滿腋芽及頂芽的休眠枝，用清水反復沖洗后，枝條上端要用錫紙包住，以防水分散失，放在恒溫室里進行水培。水培期間，每天換水1次并進行清洗，適時將水培枝條基部減掉一點，以免枝條分泌物將導管堵塞，導致枝條因缺水干枯。約2周左右，腋芽萌發出嫩枝。

1.2 試驗方法

（1）培養基及培養條件。以WPM為基本培養基，蔗糖濃度為25%，瓊脂為7 g·L-1，pH值5.7。培養基在121 ℃、131 kPa的條件下滅菌15 min。培養室溫度25±1 ℃，光照強度5 000 Lx，光周期16 h光照/8 h黑暗。

（2）無菌材料獲得。當腋芽長到3～4 cm時，在清水中滴入1～2滴洗滌劑，將芽放入清洗約5 min，再用清水反復漂洗干凈。在超凈工作臺內，先用75%酒精浸泡30 s，然后在用3%的次氯酸鈉溶液消毒15 min，再用無菌水清洗3次，放在無菌濾紙上吸干水分，將兩頭切去1～2 mm后接入芽誘導培養基中。

（3）芽的誘導培養。將處理好的外植體接種于添加6-BA0.1、0.5、1.0 mg·L-1和NAA0.02、0.1、0.2 mg·L-1組合的誘導培養基中（表1），每瓶接一個外植體，每個處理重復15次，將接種好的培養瓶放入培養室里培養，每隔一周觀察生長情況，四周后統計芽誘導和愈傷組織產生情況。

（4）莖段愈傷組織誘導。將6-BA0、0.1、1 mg·L-1和NAA 0、0.02、0.2 mg·L-1及2，4-D 0.2、2.0 mg·L-1三種激素組合的15種處理的培養基中（表2）每個處理接種12個莖段，放培養室培養，20 d后調查愈傷組織生長情況，然后將誘導產生的愈傷組織接種到愈傷組織分化的培養基里。

（5）芽增殖培養。

將誘導的無菌苗切下，切成1.5 cm左右莖段，每段至少一個腋芽，轉接到添加6-BA0、0.1、1.0 mg·L-1和NAA0、0.02、0.2 mg·L-1、GA3 0、0.5、1.0 mg·L-1組合的15種處理的增殖培養基中（表3），5周后觀察試管苗生長情況。

（6）生根培養。

選取2 cm左右長、長勢好的無菌苗，接種到添加NAA0.05、0.1、0.2 mg·L-1和IBA0.1、0.5、1.0 mg·L-1的生根培養基中（表4），2周后可誘導出不定根，4周后開始觀察根的生長情況，統計生根率。

（7）煉苗移栽。

當幼苗在培養瓶中生根后，即可進行煉苗移栽。先將生根瓶苗連瓶拿到溫室內煉苗1周，煉苗后將健壯的生根苗取出，用清水洗去根上附著的培養基，移栽到消毒準備好的蛭石∶珍珠巖=3∶1基質的營養缽中，淋透水，蓋上薄膜，置于溫室，注意遮蔭保濕，濕度控制在90%左右。10 d后逐漸揭開薄膜至完全過渡到自然條件。移栽后1周用消毒液進行1次殺菌，2周噴1次營養液。1 d噴2～3次水。

2 結果與分析

2.1 不同濃度植物激素對芽誘導的影響

由表1可見，在所設9個處理組合中，處理5培養條件為WPM+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1時，芽的誘導率最高為86.7%，其次是處理4和7處理，誘導率達80.0%，但芽苗葉色發黃，從芽苗生長情況來看，處理5的芽苗長勢最好，苗高色綠。萌芽率最低的是處理9，僅為40.0%。在不同濃度激素配比的培養基中出現了不同程度的愈傷組織，除9號處理愈傷組織量少顏色是棕褐色外，其它處理顏色淺綠或深綠色、松散。由此得出適合賽黑樺芽的誘導最佳培養條件為WPM+6-BA0.5 mg·L-1+NAA0.1 mg·L-1。

2.2 不同濃度植物激素對莖段愈傷組織誘導的影響

由表2可見，在培養基中不添加植物激素，不能誘導出愈傷組織；在所有添加植物激素的處理中均能誘導出愈傷組織，誘導率最低為50%，最高為100%。隨著激素6-BA濃度的升高，愈傷組織誘導率也隨之升高。6-BA+NAA與6-BA+2，4-D對賽黑樺莖段愈傷組織的誘導效果基本相同，因此適合賽黑樺愈傷組織誘導的最佳培養基為WPM+6-BA1.0 mg·L-1+NAA 0.02 mg·L-1。

2.3 不同濃度植物激素對芽增殖的影響

由表3可見，不添加任何植物激素的WPM培養基中其基部不產生不定芽。添加一定濃度6-BA、NAA和GA3的培養基均有不同程度的不定芽產生，增殖系數最低為1.2，最高為4.0。隨著6-BA激素濃度增加，芽增殖系數呈上升趨勢；當添加NAA后，芽長勢情況較好，莖桿壯實，但隨著NAA濃度的增加，增殖系數呈現下降趨勢，說明6-BA、NAA的配比濃度對芽增殖及長勢影響較大。在6-BA、GA3配比中，芽生長情況一般，植株偏矮，莖稈偏細，不利于煉苗移栽。綜合考慮，賽黑樺在增殖過程中的最佳培養條件為WPM+6-BA 0.1 mg·L-1+NAA 0.02 mg·L-1，增殖系數4.0，瓶苗長勢情況好，生長健壯，有利于后續煉苗移栽。

當最佳增殖培養基篩選出來后，根據多年經驗，直接將誘導產生的愈傷組織接種到最佳增殖培養基中進行愈傷組織分化培養，沒有進行不同植物激素配比對愈傷組織分化的影響進行對比試驗。培養15 d后，脫分化產生綠色芽點，進一步分化產生不定芽。顏色淺的愈傷組織生長快、芽數多，而顏色深的愈傷組織生長緩慢，芽的誘導率低。棕褐色的愈傷組織芽的誘導率最低，有的根本就沒芽誘導出來，甚至最后褐化死亡。

2.4 不同植物激素對生根的影響

由表4可見，隨著NAA濃度的增加，生根率出現下降的趨勢，當NAA的濃度為0.05 mg·L-1時，生根率為91.7%，根粗壯且長勢較強，NAA為0.20 mg·L-1時，生根率為66.7%，且根細弱，表明較高濃度的NAA不利于根的生長。IBA的作用效果與NAA相似，也是隨著濃度的增加生根率呈下降趨勢，IBA濃度降為0.1 mg·L-1時，生根率最高為 83.3 %；IBA濃度增加至1.0 mg·L-1時，生根率僅為58.3%，且莖段切口有愈傷組織產生。綜合判斷，賽黑樺的最佳生根培養基為WPM+ NAA0.05 mg·L-1。

2.5 煉苗移栽

瓶苗生根后，煉苗1周，洗凈培養基，移栽在準備好的育苗基質中進行煉苗，結果表明只要在前期對水分和溫度管理好，其成活率可以達到90%以上，并且后期長勢旺盛。

3 結論與討論

通過對賽黑樺腋芽的培養，探索出適宜腋芽誘導的培養基為 WPM+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1，在培養過程中，產生了愈傷組織，愈傷組織的產生在一定程度上影響了誘導系數，應注意植物激素的濃度配比。芽增殖最適培養基為WPM+6-BA 0.1 mg·L-1+NAA 0.02 mg·L-1，增殖系數為4.0，莖段愈傷組織誘導的培養基為WPM+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.02 mg·L-1，顏色淺的愈傷組織質地較疏軟、突起較明顯，生長快、芽數多。在生根培養中，NAA比IBA對生根更有利，最佳生根培養基為WPM+ NAA0.05 mg·L-1，生根率達91.7%。在生根培養中，為了提高煉苗成活率，在可能的情況下生根培養盡可能放到溫度與外界一樣的環境中，這樣瓶苗逐步適應了外界環境溫度變化，有利于葉表面蠟質層的恢復。移栽時采用蛭石∶珍珠巖=3∶1為煉苗基質，并在前期注意保持煉苗濕度，可以獲得賽黑樺組培苗90%以上的成活率。

參 考 文 獻

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（責任編輯：夏劍萍）