美沙拉嗪緩釋片單劑量與多劑量給藥在Beagle犬體內的藥動學研究

向榮鳳 喻明潔 熊麗蓉 戴青 李曉宇 陳勇川

摘 要 目的：建立測定Beagle犬血漿中美沙拉嗪血藥濃度的方法，并用于美沙拉嗪緩釋片在Beagle犬體內的藥動學研究。方法：采用高效液相色譜-串聯質譜法（HPLC-MS/MS）測定美沙拉嗪血藥濃度。血漿樣品加入水楊酸作為內標，經乙腈沉淀蛋白預處理；采用Inertsil ODS-3為色譜柱，乙腈-10 mmol/L乙酸銨溶液（含0.2%甲酸）（85 ∶ 15，V/V）為流動相；以電噴霧離子源（負離子模式）檢測，多反應監測模式掃描，用于定量分析的離子對分別為m/z 152.0→107.9（美沙拉嗪）、m/z 137.0→92.9（內標）。取Beagle犬6只，單劑量（1.2 g）和多劑量（每天1.2 g，連續7 d）給予美沙拉嗪緩釋片，采集各時間點血樣，測定血漿中藥物濃度。采用DAS 3.3.1數據處理軟件計算不同給藥方式下的藥動學參數以及多劑量給藥后的蓄積因子（R），并采用SPSS 16.0軟件進行藥動學參數的組間比較。結果：美沙拉嗪血藥濃度在0.1～100 μg/mL范圍內線性關系良好（r=0.999 1），定量下限為0.1 μg/mL；批內、批間精密度及基質效應試驗的RSD均小于11%；相對誤差（RE）為-0.75%～10.45%；提取回收率大于60%（RSD<5%）；穩定性試驗的RSD小于10%，RE在±15%范圍內。單劑量、多劑量給予美沙拉嗪緩釋片后，Beagle犬體內美沙拉嗪的達峰濃度（cmax）、達峰時間（tmax）、血藥濃度-時間曲線下面積（AUC0-t、AUC0-∞）、滯留時間（MRT0-t）、滯留方差（VRT0-t）、清除率（CLz）、消除半衰期（t1/2z）差異均無統計學意義（P>0.05），多劑量給藥的R均值小于1.01。結論：本方法準確、快速、靈敏、專屬性強，適用于美沙拉嗪緩釋片在Beagle犬體內的藥動學研究；單劑量和多劑量給藥后，美沙拉嗪在Beagle犬體內的藥動學特征一致，且多劑量給藥未導致藥物蓄積現象的發生。

關鍵詞 美沙拉嗪緩釋片；高效液相色譜-串聯質譜法；Beagle犬；藥動學

中圖分類號 R969.1；R917 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）16-2198-05

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish a method for the determination of mesalazine concentration in plasma of Beagle dogs， and to study the pharmacokinetics of Mesalazine sustained-release tablets in Beagle dogs. METHODS： HPLC-MS/MS method was used to determine the plasma concentration of mesalazine. Using salicylic acid as internal standard， after pre-treatment of acetonitrile precipitated protein， the determination was performed on Inertsil ODS-3 column with mobile phase consisted of acetonitrile-10 mmol/L ammonium acetate （containing 0.2% formic acid） solution （85 ∶ 15，V/V）. ESI source （negative ion mode） detection was adopted in MRM mode， and the ion pair for quantity analysis were m/z 152.0→107.9 （mesalazine） and m/z 137.0→92.9 （internal standard）. Six Beagle dogs were selected and given single dose （1.2 g） and multiple dose （1.2 g each day， for consecutive 7 d） of Mesalazine sustained-release tablets. Blood sample was collected at different time points， and plasma concentration was determined. DAS 3.3.1 software was used to calculate pharmacokinetic parameters of different doses administration and accumulation factor （R） of multiple dose administration. Pharmacokinetic parameters were compared by using SPSS 16.0 software. RESULTS： The linear range of mesalazine concentration were 0.1-100 μg/mL （r=0.999 1）， and minimum quantification limit was 0.1 μg/mL. The RSDs of inter-batch and intra-batch precision and matrix effect were all less than 11%. Relative error （RE） of accuracy ranged -0.75%-10.45%； extraction recovery was higher than 60% （RSD<5%）. RSDs of stability tests were lower than 10%， and RE was within ±15%. After administration of single dose and multiple dose， there was no statistical significance in peak concentration （cmax）， peak time （tmax）， area under curve of plasma concentration-time curve （AUC0-t， AUC0-∞）， retention time （MRT0-t）， retention variance （VRT0-t）， clearance rate （CLz） or elimination half life （t1/2z） of mesalazine （P>0.05）. The R of multiple dose was less than 1.01. CONCLUSIONS： The method is accurate， rapid， sensitive and specific， which is suitable for pharmacokinetic study of Mesalazine sustained-release tablets in Beagle dogs. After single dose and multiple dose administration，mesalazine has same pharmacokinetic characteristics in Beagle dogs， but no drug accumulation is found.

KEYWORDS Mesalazine substained-release tablets； HPLC- MS/MS； Beagle dog； Pharmacokinetics

美沙拉嗪（Mesalazine）的化學名為5-氨基水楊酸，是一種用于治療炎性腸?。ㄈ鐫冃越Y腸炎、溫和的克羅恩病等）的抗炎藥，其主要是通過抑制白三烯、前列腺素E及自由基的產生而發揮抗炎作用[1-2]。美沙拉嗪口服后能被迅速吸收，在腸腔及肝臟中主要經N-乙酰轉移酶代謝為產物N-乙酰-美沙拉嗪[3]。與其他同類藥物比較，美沙拉嗪結構簡單、毒副作用小且長期用藥可降低潰瘍性結腸炎相關性結直腸癌的發病率，因此近30年來一直被公認為誘導緩解和維持緩解輕中度潰瘍性結腸炎的一線藥物[4]。但由于其普通制劑在口服后大部分經上消化道吸收，僅少量藥物可到達結直腸，所以美沙拉嗪通常被制成能在回腸或結腸釋放的緩控釋制劑，以使其能在炎癥部位發揮更好的作用[5]。但由于輔料、pH值等制備工藝參數的差異，不同來源的美沙拉嗪緩控釋制劑的釋放行為也隨之不同，因此有必要對該藥的體內藥動學特征進行研究。

據文獻報道，美沙拉嗪血藥濃度的測定多采用高效液相色譜法（HPLC）[6-8]、液相色譜-串聯質譜法（LC-MS/MS）[3，9-10]等；同時，國內文獻僅報道了美沙拉嗪單劑量給藥后在Beagle犬體內的藥動學研究[9]，而未見多劑量給藥后的藥動學研究報道?；诖?，本課題組以進口美沙拉嗪緩釋片為試驗藥物，建立測定Beagle犬血漿中美沙拉嗪血藥濃度的高效液相色譜-串聯質譜法（HPLC-MS/MS），并研究該制劑在Beagle犬體內的藥動學特征，同時考察單劑量與多劑量給藥后的藥動學過程的差異，以及多劑量給藥后的藥物蓄積情況，以期為相關仿制制劑的結腸靶向效果評價及后續開發提供實驗依據。

1 材料

1.1 儀器

1100 Series型HPLC儀（美國Agilent公司）；AB QTRAP2000型質譜儀、Analyst 1.4.2數據采集和處理系統（美國AB Sciex公司）；BP211D型電子天平（德國Sartorius公司）；Biofuge primo R型低溫離心機（美國Thermo Fisher Scientific公司）；KDC-20型低速離心機（科大創興股份有限公司中佳分公司）；GENIUS 3型旋渦混勻器（德國IKA公司）。

1.2 藥品與試劑

美沙拉嗪緩釋片（商品名：Lialda，美國Shire US公司，批號：WD084A，規格：1.2 g/片）；美沙拉嗪對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100565-200701，純度：99.9%）；水楊酸對照品（內標，美國Alfa Aesar公司，批號：10154219，純度：99%）；甲醇、乙腈、甲酸、乙酸銨均為色譜純，水為超純水。

1.3 動物

Beagle犬6只，雌雄各半，體質量9～12 kg，普通級[動物生產許可證號：SCXK（渝）2012-0006]，由重慶市中藥研究院實驗動物研究所提供；經體檢證明健康，實驗前及實驗期間未服用其他任何藥物，實驗期間統一飲食。

2 方法與結果

2.1 色譜與質譜條件

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Inertsil ODS-3（50 mm×2.1 mm，5 μm）；流動相：乙腈-10 mmol/L乙酸銨溶液（含0.2%甲酸）（85 ∶ 15，V/V）；流速：0.2 mL/min；柱溫：35 ℃；進樣量：10 ?L。

2.1.2 質譜條件 離子源：電噴霧離子源（負離子模式），多反應監測（MRM）；用于定量分析的離子對：m/z 152.0→107.9（美沙拉嗪）、m/z 137.0→92.9（內標）；離子源電壓：-4 500 V；離子源溫度：400 ℃；去簇電壓（DP）：-24.9 V/-27.0 V；碰撞能（CE）：-16.5 V/-22.0 V。美沙拉嗪和內標的二級質譜子離子掃描圖見圖1。

2.2 溶液的制備

精密稱取美沙拉嗪對照品適量，置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，制得質量濃度為1.0 mg/mL的美沙拉嗪對照品貯備液；精密量取該貯備液適量，用甲醇逐級稀釋，制得質量濃度分別為0.4、0.2、0.08、0.02、0.005、0.002、0.001 mg/mL的系列對照品溶液。另精密稱取水楊酸對照品適量，置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，制得質量濃度為1.0 mg/mL的水楊酸對照品貯備液；精密量取該貯備液適量，用甲醇稀釋制得質量濃度為10 μg/mL的水楊酸對照品溶液，即內標溶液。

2.3 血漿樣品的處理

取待測血漿樣品200 μL，加入內標溶液10 μL，渦旋混勻0.5 min；加入乙腈600 μL，渦旋混勻2 min；13 000 r/min離心5 min，取上清液10 μL進樣測定。

2.4 方法學考察

2.4.1 專屬性試驗 分別取Beagle犬空白血漿200 μL，按“2.3”項下方法預處理（不加入內標），再按“2.1”項下色譜與質譜條件進樣測定；在上述空白血漿中加入一定質量濃度的美沙拉嗪對照品溶液制成含藥血漿，同法預處理（需加入內標）并進樣測定；取Beagle犬單劑量給藥后24 h時的血漿樣品200 μL，同法預處理（需加入內標）并進樣測定。記錄上述樣品的典型MRM色譜圖，見圖2。結果顯示，美沙拉嗪和內標的保留時間分別約為0.63、0.69 min，空白血漿中的內源性物質不干擾兩者的測定。

2.4.2 標準曲線的繪制與定量下限的考察 取空白血漿180 μL，分別加入質量濃度為1.0、0.4、0.2、0.08、0.02、0.005、0.002、0.001 mg/mL的美沙拉嗪對照品溶液20 μL，混勻，制得含美沙拉嗪分別為100、40、20、8、2、0.5、0.2、0.1 μg/mL的系列含藥血漿樣品，按“2.3”項下方法預處理，再按“2.1”項下色譜與質譜條件進樣測定，記錄色譜圖。以待測物質量濃度（c，μg/mL）為橫坐標、待測物峰面積（As）與內標峰面積（Ar）之比（y）為縱坐標進行線性回歸，得標準曲線方程為y=0.206c+0.003 08（r=0.999 1）。另同法配制含美沙拉嗪0.1 μg/mL的血漿樣品，平行制備5份，預處理后進樣測定，結果血藥濃度的RSD為13.03%（n=5）。結果表明，美沙拉嗪血藥濃度在0.1～100 μg/mL范圍內線性關系良好，本方法定量下限為0.1 μg/mL。

2.4.3 精密度與準確度試驗 按“2.4.2”項下方法配制高、中、低、定量下限4個質量濃度（80、8、0.2、0.1 μg/mL）的美沙拉嗪血漿樣品，均平行5個樣本分析，同法預處理后在同一個分析批內進樣測定，代入標準曲線計算血藥濃度，考察本方法的批內精密度和準確度[以相對誤差（RE）表示，下同]；同法連續3 d進樣測定，分別代入隨行標準曲線計算血藥濃度，考察本方法的批間精密度和準確度。結果顯示，批內和批間RSD均小于11%，RE為-0.75%～10.45%，詳見表1。

2.4.4 提取回收率試驗 按“2.4.2”項下方法配制高、中、低3個質量濃度（80、8、0.2 μg/mL）的美沙拉嗪血漿樣品，均平行5個樣本分析，同法預處理后進樣測定；另配制同樣質量濃度的美沙拉嗪對照品水溶液，均平行5個樣本分析，同法預處理后進樣測定。根據測得的血漿中美沙拉嗪峰面積與對應水溶液中美沙拉嗪峰面積之比計算其提取回收率。結果顯示，提取回收率均大于60%，RSD均小于5%，詳見表2。

2.4.5 基質效應試驗 分別取6只Beagle犬空白血漿200 μL，按“2.3”項下方法預處理，取上清液作為溶劑，配制含美沙拉嗪0.2 μg/mL的溶液，進樣測定，得峰面積（A基質）；另配制含美沙拉嗪0.2 μg/mL的甲醇溶液，進樣測定，得峰面積（A標準）；按公式（A基質/A標準×100%）計算得基質效應因子（MF）。同法操作并測得內標的MF。結果顯示，以美沙拉嗪與內標的MF比值計算得內標歸一化基質效應因子為（101.74±8.54）%，RSD為8.39%（n=6），表明在本實驗色譜與質譜條件下可忽略基質效應的影響。

2.4.6 穩定性試驗 按“2.4.2”項下方法配制高、中、低3個質量濃度（80、8、0.2 μg/mL）的美沙拉嗪血漿樣品，考察其于室溫放置3 h、反復凍融（-70 ℃至室溫）3次、-70 ℃冷凍6周以及經預處理后室溫放置16 h的穩定性，均平行3個樣本分析。結果顯示，所有條件下樣品血藥濃度實測值的RSD均小于10%（n=3），實測值與理論值的RE均在±15%范圍內，表明美沙拉嗪血漿樣品穩定性良好，詳見表3。

2.5 藥動學實驗

2.5.1 單劑量給藥實驗 取6只Beagle犬，于實驗前禁食不禁水過夜（≥10 h）。次日早晨將美沙拉嗪緩釋片1片置于犬舌后部（1.2 g/只），喂水20 mL并確認藥片已被吞下后，將犬放入籠中。于給藥前（0 h）及給藥后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、14、16、24、32、48 h時，分別自每只犬前肢頭靜脈取血2 mL，置于肝素化試管中，3 000 r/min離心5 min，取血漿于-70 ℃保存，待測。

2.5.2 多劑量給藥實驗 單劑量給藥結束2周后，對6只Beagle犬禁食不禁水過夜（≥10 h），于次日早晨按“2.5.1”項下給藥方法，給予美沙拉嗪緩釋片1片，qd，連續給藥7 d。于第5、6、7天給藥前及第7天給藥后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、14、16、24、32、48 h時，分別自每只犬前肢頭靜脈取血2 mL，置于肝素化試管中，3 000 r/min離心5 min，取血漿于-70 ℃保存，待測。

2.5.3 血藥濃度-時間曲線繪制 取6只Beagle犬單劑量和多劑量給予美沙拉嗪緩釋片后的血漿樣品，采用“2.3”項下方法預處理，再按“2.1”項下色譜與質譜條件進樣測定，代入隨行標準曲線計算血藥濃度，并繪制平均血藥濃度-時間曲線，詳見圖3。

2.5.4 藥動學參數計算 采用DAS 3.3.1數據處理軟件對單劑量與多劑量給藥后美沙拉嗪血藥濃度的實測值進行統計分析，計算藥動學參數，結果見表4；同時，采用SPSS 16.0軟件對單劑量與多劑量給藥后的藥動學參數進行t檢驗，以P<0.05表示差異有統計學意義。結果顯示，單劑量與多劑量給藥的達峰濃度（cmax）、達峰時間（tmax）、血藥濃度-時間曲線下面積（AUC0-t、AUC0-∞）、滯留時間（MRT0-t）、滯留方差（VRT0-t）、清除率（CL）、消除半衰期（t1/2z）差異均無統計學意義（P>0.05），表明單劑量與多劑量給藥后美沙拉嗪在Beagle犬體內的藥動學參數未發生明顯變化。

2.5.5 多劑量給藥后Beagle犬體內的藥物蓄積評價 采用DAS 3.3.1數據處理軟件分別對6只Beagle犬的單劑量給藥后的藥動學參數cmax、AUC0-t和多劑量給藥后的藥動學參數AUCss、穩態cmax（cmaxss，即表4中的cmax，為最后一次給藥后的達峰濃度）進行計算，并按公式（Rcmax=cmaxss/cmax；RAUC=AUCss/AUC0-t[11]）計算多劑量給藥后美沙拉嗪在Beagle犬體內的蓄積因子（R），結果見表5。由表5可見，多劑量給藥后美沙拉嗪的Rcmax、RAUC均值均小于1.01，表明美沙拉嗪多劑量給藥在Beagle犬體內未發生藥物蓄積現象[11]。

3 討論

本實驗建立了測定Beagle 犬血漿中美沙拉嗪濃度的HPLC-MS/MS方法，并對該方法進行了方法學考察。結果表明，所建方法適用于美沙拉嗪緩釋片在Beagle犬體內的藥動學研究。本研究單劑量給藥后藥動學參數與已有文獻結果[9]比較后顯示，t1/2z較為一致，但tmax、cmax、AUC等參數存在差異?？紤]其主要原因一是由于犬個體間差異，二是由于實驗用制劑的廠家工藝不同。本實驗選用的試驗藥物為進口制劑，緩釋性能良好，因此tmax較國產制劑明顯延長，cmax相對較低，AUC相對較高。

動物實驗結果顯示，6只Beagle犬單劑量與多劑量給予美沙拉嗪緩釋片后cmax和AUC0-t的RSD均大于50%，表明Beagle犬的藥動學參數個體差異較大。分析其原因，可能是因為美沙拉嗪緩釋片作為一種在回腸末端釋放的局部抗炎制劑，在結腸部位的停留時間相對較短，藥物的吸收容易受結腸的排空時間和結腸內容物的干燥程度所影響。

此外，6只Beagle犬單劑量與多劑量給予美沙拉嗪緩釋片后主要的藥動學參數無統計學差異，表明多劑量給藥對其體內藥動學過程無明顯影響；蓄積因子Rcmax為1.00±0.16，RAUC為0.88±0.15，表明美沙拉嗪緩釋片多劑量給藥后在犬體內不產生藥物蓄積。然而，由于Beagle犬與人體胃腸道的生理學差異，使得兩者對該制劑的釋放和吸收行為有所不同，因此有待于對該制劑在人體內的藥動學行為作進一步研究。

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（收稿日期：2018-01-29 修回日期：2018-07-02）

（編輯：段思怡）