L-色氨酸重組高產菌株發酵工藝的優化

呂磊，宋國田，劉永飛，劉燕霏，楊建德，通信作者，張大偉，通信作者

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L-色氨酸重組高產菌株發酵工藝的優化

呂磊1，宋國田2，劉永飛2，劉燕霏1，楊建德1，通信作者，張大偉2，通信作者

（1. 天津農學院 動物科學與動物醫學學院，天津 300384；2. 中國科學院 天津工業生物技術研究所，天津 300380）

L-色氨酸（L-tryptophan，L-Trp）是一種限制性氨基酸，是人體和動物體生長發育等重要生理活動的必需氨基酸之一，也是合成許多活性物質的關鍵氨基酸之一，廣泛應用于醫藥、飼料和食品等方面，具有十分重要的商業價值。微生物發酵生產的L-色氨酸近些年來一直備受關注，主要是因為其價格低廉、純度高、易分離等特點，因此利用微生物生產L-色氨酸在大規模工業生產上具有十分可觀的應用前景。利用色氨酸高產基因，經基因工程重組到大腸桿菌內，篩選出色氨酸高產菌株。通過控制溶氧、碳源、pH值及殘糖含量來有效提高L-色氨酸的產量。利用原始菌株探究發酵過程中發酵罐內的殘糖含量，發現殘糖含量控制在1% 時，菌體生長最為良好，生長周期最長。將不同比例的糖蜜與葡萄糖混合，作為發酵時的碳源，結果顯示當比例為3∶1時L-色氨酸產量最大；在發酵過程中控制pH條件，將產量提高到18.9 g/L；將溶氧條件控制在35%、40% 兩個范圍，結果顯示溶氧40% 時L-色氨酸的產量達到27 g/L；將補料碳源換為60% 的葡萄糖及70% 的小麥糖，結果顯示葡萄糖作為唯一碳源時，L-色氨酸產量較高。

L-色氨酸；發酵；優化；高產菌株

L-色氨酸是人體和動物生命活動八種必需氨基酸之一，對人和動物的生長發育、新陳代謝起重要作用，被稱為第二必需氨基酸，廣泛應用于醫藥、食品和飼料等方面[1-2]。在食品工業上主要用作食品營養增補劑，國內外多地都將L-色氨酸制成食品添加劑，當機體攝入這些食品后會產生許多積極的影響，例如提高人體對植物蛋白質的利用率，加速蛋白分解利用[3]等。L-色氨酸可參與體內脂肪代謝、降低動物肝臟脂肪含量，從而達到提高禽畜瘦肉比的目的[4]。色氨酸在醫學方面的應用也十分廣泛，起著不可或缺的作用。色氨酸對治療失眠癥、抑郁癥、躁狂癥和止痛有顯著效果。臨床研究發現，L-色氨酸與鐵劑、維生素合用可增強治療運動性貧血的療效，與組氨酸一起使用還可治療消化道潰瘍[5]。

目前，世界上L-色氨酸的市場年需求量在5萬t以上[6]，世界范圍內生產和消耗嚴重不平衡，在眾多生產方法中發酵法是較為廉價合適的方法，然而在生產菌過程中存在很多復雜調控因子致使難以實現工業化，呈現出供不應求的狀況，所以開發出一種新的低成本的色氨酸高產菌，實現工業化生產迫在眉睫。近年來，隨著重組DNA技術的不斷發展、成熟，利用微生物發酵生產L-色氨酸的研究突飛猛進。這種技術主要克服了超遠緣雜交育種的障礙，將所需的目的基因即將微生物具有的氨基酸生物合酶的基因連接于質粒，再導入到大腸桿菌中，將其轉化成氨基酸生產菌，達到所需基因擴增、酶量增加的目的，從而提高氨基酸轉化率。但技術要求非常高，實施困難很大，還有很多不確定因素，現今國外只有幾家公司大規模工業化生產L-色氨酸，其中三家日本公司是利用微生物法生產L-色氨酸，主要應用于生產飼料添加劑方面。

本文利用葡萄糖、糖蜜及小麥糖，在3 L發酵罐中發酵生產L-色氨酸。通過多次直接發酵實驗，改變發酵時的碳源、溶氧、pH及殘糖含量的指標，來優化發酵工藝，檢測分析L-色氨酸的產量，盡可能提高其產量，從而降低工業生產成本，實現大規模工業化生產。

1 材料與方法

1.1 主要菌株、溶液和試劑

1.1.1 發酵所用色氨酸工程菌為中科院天津工業生物技術研究所開發的菌株XLLT-4。

60% 葡萄糖溶液：稱取660 g一水合葡萄糖，加蒸餾水定容至1 L，作為發酵時的補料碳源和糖蜜及70%小麥糖一起115 ℃ 滅菌30 min；

四環素（15 mg/mL）：稱取0.15 g四環素粉末，加無水乙醇定容至10 mL，過濾除菌，因為試驗菌株帶有四環素抗性，所以四環素主要作用是防止培養基中生長雜菌；

30%（/）磷酸：量取30 mL的磷酸溶液并加入70 mL的去離子水，主要用于發酵過程控制發酵液pH；

MgSO4·7H2O：稱取1 g MgSO4·7H2O固體用去離子水定容至2 mL，過濾除菌，作為大腸桿菌生長繁殖所必需的微量元素；

FeSO4·7H2O：稱取7.5 mg FeSO4·7H2O用去離子水定溶至500 μL，過濾除菌，作為大腸桿菌生長繁殖所必需的微量元素；

L-絲氨酸（L-ser）：稱取0.5 g L-ser粉末溶于10 mL去離子水中，121 ℃滅菌30 min，L-絲氨酸是合成L-色氨酸必備的前體物質；

10% 異丙醇：量取10 mL的異丙醇，用去離子水定容至1 L，進行各項測試時都需用10%異丙醇沖洗色譜柱。

1.1.2 試管LB培養基按常規方法制備，用于活化凍存菌株，37 ℃，220 r/min，14～16 h。

1.1.3 種子培養基（/L）：60%葡萄糖 20 g，酵母粉 15 g，檸檬酸鈉0.5 g，KH2PO41.5 g，FeSO4· 7H2O 15 mg，VB1100 mg，MgSO4·7H2O 1 g。

按發酵罐工作體積（1 L）10% 的接種量制備種子培養基，按比例稱取兩份，攪拌均勻，分裝入兩個500 mL搖瓶中，121 ℃滅菌20 min。

取出隔夜活化的LB試管培養基，按1∶100的比例轉接入種子培養基，37 ℃，220 r/min，14～16 h。

1.1.4 發酵罐培養基（/L）：60%葡萄糖20 g，（NH4）2SO410 g，KH2PO45 g，MgSO45 g，酵母粉2 g，FeSO4·7H2O 15 mg，MnSO4·H2O 15 mg，CuSO4·5H2O 4 mg，CoCl2·6H2O 4 mg，ZnSO4·7H2O 4 mg，生物素 30 μg，L-絲氨酸 0.5 g和甜菜堿 1 g。

所用3 L發酵罐工作時裝液量為1 L，配制雙份，需要用1.8 L的蒸餾水溶解試劑，121 ℃ 滅菌20 min。

1.1.5 色譜工作液：根據液相色譜儀操作說明，配制A、B、C、D相，如下。

A相是稱取12.436 g磷酸二氫鈉（色譜純）定容至2 L去離子水中，并用氫氧化鈉準確調節pH為7.8。

B相是將甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）、去離子水按照體積比45∶45∶10在通風櫥稱量混勻。

C相是水相，量取1 L去離子水。

D相是10%的異丙醇，100 mL異丙醇溶于900 mL去離子水中。

流動相藥品均需抽濾，再做超聲處理，以除去溶液配制時產生的氣泡，避免對液相色譜儀及色譜柱造成損壞。

配制標品時，先配制L-色氨酸母液，濃度為10 g/L。稱取10 mg L-色氨酸溶于1 mL去離子水中。再利用母液分別配制濃度為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g/L的樣品。配制完成后用1 mL注射器和無水濾膜過濾，各取1 mL裝入樣品瓶中即可。

1.2 方法

本文利用實驗室改造并篩選出的L-色氨酸高產菌，采用微生物直接發酵法生產L-色氨酸。每批次做兩個試驗，互為對照，利用3 L發酵罐發酵。在發酵開始前，保證除單一變量（溶氧、pH、殘糖含量及碳源）外的所有條件基本一致，這樣不會影響結果分析。在發酵開始后，每隔2 h測一次600（細菌光密度），在600為60左右時，開始留樣，以便檢測L-色氨酸產量。試驗目的是為實現大規模工業化生產L-色氨酸，所以初次試驗采用混合碳源作為發酵補料，但也應保持葡萄糖與糖蜜的比例適中。首次試驗參照文獻[4]的方法，將發酵時的溶氧控制在30%?？紤]到發酵時可能會有副產物乙酸產生，所以將pH初步設定在7.0；第二次試驗參照文獻[5]的方法，將pH改為6.8，并設置了pH為6.6的對照試驗組；由于本試驗菌株與文獻中的菌株不同，在分析第二次試驗結果后，將溶氧濃度改為40%，并設置了對照試驗組溶氧濃度45%，產量明顯提高。最后利用60%的葡萄糖和70%的小麥糖做檢測試驗，結果顯示葡萄糖作為唯一碳源時，L-色氨酸的產量最高。

實驗最后一步是使用HPLC法測定發酵液中色氨酸濃度，在一定濃度范圍（0.5～2.5 g/L）內，色氨酸吸收峰峰面積與色氨酸濃度呈線性關系（圖1）。利用圖1公式可計算出每批次發酵的L-色氨酸的濃度。

圖1 HPLC法檢測色氨酸濃度的標準曲線

色氨酸的轉化率大致分為兩個部分。當用60%葡萄糖或70%小麥糖作為碳源時，色氨酸轉化率代表色氨酸總產量（g）/消耗糖液中的60%葡萄糖或小麥糖總量（g）×100%；當用糖蜜作為碳源時，色氨酸轉化率代表色氨酸總產量（g）/底糖和補料消耗糖蜜與葡萄糖混糖總量（g）×100%。

2 結果與分析

2.1 不同比例混合碳源對L-色氨酸發酵的影響

在進行首次發酵實驗時，將葡萄糖和糖蜜分別以1∶6和1∶3的比例混勻，作為補料碳源，結果如圖2所示。

圖2 不同比例混合碳源對L-色氨酸發酵的影響

注：差異顯著性＝0.06

根據圖2可知，不同比例混合碳源對發酵罐內菌體量及L-色氨酸產量的影響有所差異，最明顯的是菌體量。在葡萄糖：糖蜜為1∶6的發酵罐中，菌體量600值為47.2，而改變二者比例為1∶3時，600提高了56.4%。菌體量提高后，相應L-色氨酸產量也明顯提高。

2.2 pH值對L-色氨酸發酵的影響

因為發酵過程中，大腸桿菌會有些副產物，例如乙酸等，會使發酵液變酸，影響菌體生長代謝，所以在第一次試驗的基礎上，改變第二次試驗中發酵罐內的pH值，分別為6.8、6.6，結果如圖3所示。

圖3 不同pH值對L-色氨酸發酵的影響

注：差異顯著性＝0.04

與第一次試驗中pH為7.0互為對照，研究發現，當pH為6.6時，L-色氨酸的產量比pH為6.8時還略微偏低，但與pH為7.0時相差無幾。最直觀表現在發酵罐內菌體量的差異，600值分別相差了4.8和2.4。在發酵中，菌體量是影響最后產量最為重要的因素之一，所以在下次發酵時改變pH為6.8。

2.3 溶氧對L-色氨酸發酵的影響

基于前兩次試驗的最優條件，本次改變發酵罐內的溶氧條件，結果如圖4所示。

圖4 不同溶氧對L-色氨酸發酵的影響

注：差異顯著性＝0.01

結合圖2中溶氧含量＝30% 時的數據，發現當＝40% 時L-色氨酸產量最高，達到 27 g/L，而溶氧條件的改變對菌體量的影響幾乎不大。在發酵的不同時間，大腸桿菌的菌體量及呼吸強度不同，發酵罐內的溶氧條件也不停變化，因此需調節通氣量及轉速來保持發酵罐內的溶氧濃度。由此可見，發酵時保持溶氧濃度的穩定有利于L-色氨酸產量的提高。

2.4 綜合檢測試驗

采用之前探索出的條件，再做一次驗證試驗，利用60%的葡萄糖和70%的小麥糖進行一次發酵。結果如圖5所示。

圖5 純碳源對L-色氨酸發酵的影響

注：差異顯著性＝0.002

結果顯示，利用60%的葡萄糖作為唯一碳源時，L-色氨酸的產量和菌體量均為最高，菌體量比混合碳源發酵時提高了35.2%，產量調高了135.7%，對應的轉化率也提高了2.9%。利用70%的小麥糖發酵，雖然產量和菌體量也非常高，但還是60%的葡萄糖作用效果更為明顯。

3 討論

L-色氨酸的生產最早主要依靠化學合成法和蛋白質水解法。胡永紅等[7]敘述了蛋白質水解法，由于色氨酸本身在蛋白質及各種谷物原料中含量不是很高，提取時蛋白質容易被破壞，所以此種水解蛋白質的方法并不適用。劉紅利等[8]用苯肼與丙烯醛和乙酰氨基丙二酸二乙酯的加成產物進行縮合反應，生成苯腙化合物，然后在酸性條件下環化，再在堿性條件下脫羧，最后對其水解就可得到DL-色氨酸，雖然得到較高的總收率（43.9%），但有機物污染較大，對環境和健康帶來很大威脅，結構不單一，且后續處理花費較高。許前會等[9]以蘆竹堿和海因為原料，經縮水、水解合成DL-氨基酸，收率達41.6%，但后續涉及到的碘甲烷等物質對環境危害較大，同時也具有結構不單一的不足。蓋利剛等[10]發明了一種酪氨酸、色氨酸的化學制備方法，先將含氨基聚合物、芳香醛和無機酸加入到醇水溶液中，回流，固液分離，得固體I；再將固體I和無水乙醚、氫化鋰鋁混合，攪拌，固液分離，得固體II；之后將固體II與無水乙醇和環己烷的混合溶液、有機堿及乙酰胺基丙二酸二乙酯混合，回流，固液分離，取液體，經蒸餾制得固體III；最后將固體III與無機酸溶液混合，回流，冷卻，調pH，取沉淀；于甲酸水溶液中重結晶，同樣這種方法對環境危害也較大。

Cheng等[11]研究了不同補料策略對色氨酸產量的影響，包括指數期補料、偽指數期補料、按照溶氧補料、按照發酵液中葡萄糖的量補料，實驗中控制最大比生長速率控制在0.25 h-1以下，通過這些控制使得乙酸濃度為0.9 g/L，最終色氨酸產量為38.8 g/L，葡萄糖轉化率為19.9%，這是相對很高的轉化率。為了解決碳源流向、提高轉化率問題，Lim等[12]通過UTR工程實現了精確調控葡萄糖轉運到細胞內基因的表達水平，為以后探索發酵產物的最大產量和產率提供了一種簡單方法的理論支撐。

由多次發酵試驗取得的數據對比，可以得出結論，當發酵溫度控制在37℃，溶氧條件控制在40%，pH穩定在6.8，補充碳源時，發酵罐內的殘糖量控制在1%左右時開始補糖，此時發酵效果最好，產L-色氨酸的量最多，轉化率最高，最穩定。需要注意的是，在整個發酵過程中，因為每次發酵用的菌株生長狀況不同，可根據發酵罐內菌體生長狀況適宜地調節溶氧條件，可有效提高產量。

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[11] Cheng L K，Wang J，Xu Q Y，et al. Effect of feeding strategy on L-tryptophan production by recombinant[J]. Annals of Microbiology，2012，62（4）：1625-1634.

[12] Lim J H， Jung G Y. A simple method to control glycolytic flux for the design of an optimal cell factory[J]. Biotechnology for Biofuels，2017，10（1）：160-170.

責任編輯：張愛婷

Optimization of fermentation process for recombinant high yield strain of L-tryptophan

Lü Lei1, SONG Guo-tian2, LIU Yong-fei2, LIU Yan-fei1, YANG Jian-de1,Corresponding Author, ZHANG Da-wei2,Corresponding Author

（1. College of Animal Science and Veterinary Medicine, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China; 2. Tianjin Institute of Industrial Biotechnology, Chinese Academy of Science, Tianjin 300380, China）

L-tryptophanine（L-Trp）is a kind of restricted amino acid, which is one of the essential amino acids for the growth and development of human body and animal. It is one of the key amino acids in the synthesis of many active substances and has been widely used in medicine. The production of L- tryptophan by microbial fermentation has attracted much attention in recent years, mainly because of its low price, high purity and easy separation. Therefore, the production of L-tryptophan by microorganism has a promising application prospect in large-scale industrial production. In this paper, the tryptophan high yield gene was recombined intoby genetic engineering. By controlling dissolved oxygen, pH value of carbon source and residual sugar content, the yield of L-tryptophan was effectively increased by direct fermentation. In this experiment, the original strain was used to explore the content of residual sugar in fermenting tank. It was found that when the residual sugar content was controlled at 1%, the growth of bacteria was the best and the growth cycle was the longest. When molasses were mixed with glucose as carbon source during fermentation, the results showed that the yield of L-tryptophan was the highest when the ratio was 3∶1; then when the pH was controlled during fermentation, the yield was increased to 18.9 g/L；the dissolved oxygen condition was controlled in the range of 35% and 40%. The results showed that the production of L-tryptophan reached 27 g/L at dissolved oxygen 40%; Finally, 60% glucose and 70% wheat sugar were replaced by carbon source. The results showed that the yield of L-tryptophan was higher when glucose was the sole carbon source.

L-tryptophan; fermentation; optimization; high yield strain

1008-5394（2018）03-0060-05

10.19640/j.cnki.jtau.2018.03.013

TQ922

A

2018-03-29

天津自然科學基金項目（16JCYBJC23500）

呂磊（1995-），男，本科在讀，研究方向：微生物發酵。E-mail：824951764qq.com。

楊建德（1969-）男，教授，博士，研究方向：預防獸醫學。E-mail：jiandeyang@126.com。

張大偉（1978-），男，研究員，博士，研究方向：微生物發酵。E-mail：zhang _dw@tib.cas.cn。