蘋果不同授粉方式對果實發育的影響

郭寶貝，張東霞，劉 麗，鄭永惠 ，郭成俊 ，雷紅嬰 ，吳 政 ，郭 媛

（1.山西省農業科學院果樹研究所，山西太原030031；2.山西省植物保護植物檢疫總站，山西太原030006；3.山西省晉中種蜂場，山西晉中030600；4.山西省農業科學院園藝研究所，山西太原030031）

蘋果作為落葉果樹中的重要樹種，也是享譽世界的4大水果之一，其栽培面積和分布范圍都居前列，產量效益可觀，在我國農業經濟中占據了重要位置。蘋果作為異花授粉植物，花粉直感現象在許多果實性狀上表現明顯，因此，授粉效果是果實品質的重要影響因素[1]。利用蜜蜂為經濟作物增產已經為人所熟知[2]，對蜜蜂授粉增產機制的研究主要集中在植物授粉以前的各種優勢條件上[3]，如授粉時間最佳、授粉充分、異源花粉授粉優勢、充分利用有效花等等[4-5]，然而蜜蜂授粉后對植物花部生理發育的影響卻鮮有研究。

本研究通過幾種授粉方式對蘋果授粉后花部生理發育的比較，探討蜜蜂授粉的優勢，旨在為更好地認識蜜蜂授粉提供新材料。

1 材料和方法

1.1 材料

選取榆次豆腐莊7年生紅富士蘋果樹12株，15 cm×18 cm白蠟紙袋700個；人工授粉粉源采自運城市臨猗縣張家坡村秦冠和嘎啦混合花粉。

1.2 試驗設計

2016年5月1日至6月18日在榆次豆腐莊選取試驗樣地，共設置自然授粉（N）、蜜蜂授粉（B）、自花授粉（S）和人工授粉（D）4個試驗組。每組選取樹齡、樹勢、花量一致的紅富士3株。

N組授粉方式為自然授粉；S組在5月1日開始選取氣球期花序300個套袋，并在5月3日花盛開當天進行人工自花授粉，此時授粉效果最佳[6]。D組也在5月1日選取氣球期花序300個套袋，5月3日采用4月7日在臨猗張家坡采集保存的秦冠和嘎啦混合花粉進行人工授粉，花粉保存方法采用王欽麗等[7-8]的方法。授粉時每個花序去除中心花，保留邊緣花2朵，花粉用1.5 mL EP管盛裝花粉，用鉛筆橡皮頭適量蘸取花粉，在當天已開花的柱頭上點授花粉，授粉后再將袋子套好[9-10]。B組采用蜜蜂授粉，需要套網，網內設置1株紅星和3株紅富士，選取考察枝，考察枝上保留氣球期的花，其他花全部摘除，于5月2日下午將一箱蜂放入，5月3日進行全天授粉，晚上將蜂箱搬離試驗棚。

1.3 采樣及處理方法

1.3.1 花粉萌發和花粉管生長熒光觀察試驗 對蜜蜂授粉、人工授粉和自然授粉3個組的花柱分別在 12，24，36，48，72，96 h 進行取樣，每組每次處理重復不少于20根，然后放入FAA固定液中保存。由于自花授粉組全部敗育，所以未取得花粉管材料。1.3.2 胚、胚乳生長發育情況切片試驗 共取樣16次，在5月3日授粉后2，4，6，10 h各取樣4次，5月 4，5，6日每天 9：00和 16：00各取樣 1次。5月15，19，25日，6 月 1，8，18 日每天 16：00取樣 1 次。取樣時間經歷47d。所取樣本保存在FAA固定液中。

1.4 指標測定及方法

花粉萌發、花粉管生長熒光觀察試驗參照KHO的方法[11]，并在軟化時間上做適當修改，確定為1 mol/L NaOH 40℃處理6 h，苯胺藍染色過夜。染色后用Olympus BX51顯微鏡熒光顯微系統觀察，并用顯微成像系統進行拍攝，每個處理重復不少于20根花柱。

胚、胚乳授粉后生長情況對比采用常規石蠟切片法，取樣后立即放入FAA中保存，每個樣品取3個重復。用Olympus BX51顯微鏡放大100倍觀察，并用Olympus E620數碼照相機拍照。

2 結果與分析

2.1 花粉萌發、花粉管生長情況熒光觀察

考察所有時段的采集樣品，進行花粉柱頭萌發及花粉管生長熒光觀察結果統計。蘋果柱頭花粉萌發和花粉管生長表示方法：花粉柱頭萌發情況，0為沒有花粉在柱頭萌發，1為柱頭有弱熒光，2為柱頭有強熒光，3為柱頭有超強熒光；花粉管生長情況，0為沒有花粉在柱頭萌發，1為柱頭觀察到花粉管熒光，2為花柱中部觀察到熒光，3為花柱根部觀察到熒光。統計數據列于表1，花粉柱頭萌發情況和花粉管生長情況如圖1所示。

表1 花粉管生長與柱頭花粉萌發熒光觀察情況統計 個

方差分析顯示，在P＜0.01水平上，B組柱頭花粉萌發情況與D，N組間差異極顯著；B，D組花粉管生長情況與N組間差異也極顯著（表2）。

花粉管生長對比試驗中，B組、D組間不存在顯著差異。說明利用蜜蜂授粉完全可以達到人工授粉的效果[12]；柱頭花粉萌發對比中，B組與N，D組間存在極顯著差異，并在柱頭花粉萌發強度上具有絕對優勢。B組在柱頭超強熒光的數量上占考察柱頭總數的29.66%，而D，N組僅為6.20%和2.88%。3種授粉方式中，蜜蜂在傳粉效果上具有絕對優勢。

考察花粉管生長情況，花粉管生長到花柱中部的數量占總考察花柱數的比例，D組為35.66%，B組為48.97%；花粉管生長到花柱根部的數量占總考察花柱數的比例，D組為5.43%，B組為1.38%。

表2 蘋果柱頭花粉萌發和花粉管生長熒光觀察結果（P＜0.01，S-N-K方差分析） 個

2.2 胚、胚乳生長情況觀察

2，4，6，10，24 h 切片顯示，橢圓形胚囊保持完整（圖 2-1，2），N，B，S，D 組之間沒有明顯的差別。受精后48 h珠心細胞開始解體，為胚囊發育提供營養，D組珠心解體程度比其他3組大（圖2-3，4）。72 h切片結果同48 h，D組珠心裂解程度較大。

13 d取樣切片顯示，D組水樣狀的胚乳正在逐漸消失，胚的發育正在進入加速階段，要比其他3組發育的快（圖2-5，6）。在第17天時，B，D組胚珠的正中間可以看到受精合子，體積擴大，侵蝕四周的珠心細胞，N組中沒有觀察到（圖2-7，8，9）。從13 d起，S組由于受精情況不好，花部逐漸凋零，S組不再取樣。

從5月25日即授粉后23 d的切片中看到，B組受精卵開始發育，N組中棒狀胚已經形成，D組也看到了受精卵，（圖2-10，11）。30 d取樣切片觀察可以看到，B組已經形成非常典型的心形胚（圖2-12）。而在D組，魚雷胚的雛形已經形成（圖2-13），但在N組所做的切片中，只看到了典型的球狀胚（圖2-14）。37 d切片觀察，D組已經形成比較完備的子葉型胚（圖2-16），在B組及N組，子葉型胚的發育沒有D組完備（圖2-15，17）。授粉后47 d時，D組和B組已經看到成熟胚的胚乳（圖2-18，19）。N組中沒有觀察到這一現象（圖2-20）。

3 討論

3.1 熒光觀察試驗

花粉管熒光觀察試驗表明，在花粉管抑制物開始作用以前，蜜蜂授粉促進花粉管生長情況好于人工授粉組，隨著花粉管的進一步生長，高異質性花粉生長優勢明顯，達到花柱根部的花粉管數量要多于花粉異質性低的蜜蜂授粉組。結合授粉時柱頭花粉數量情況，可以推斷D組花粉管到達花柱根部的數量比B組多的原因是由花粉異質性差別引起的。另外，花粉萌發及花粉管生長具有群體效應，D組點授的方式使得大量花粉落到柱頭上，也是花粉管長到根部數量較多的原因之一[13]。將蜜蜂授粉應用于大田授粉后，隨著蜜蜂采集花粉異質性的提高，授粉效果就會得到改善[14]。這一點在自花授粉組也得到驗證，S組由于自交不親和性導致自花授粉的花在授粉第13天后全部凋落，原因是自花授粉花柱內自交不親和性基因（S基因）所表達的S-RNase，降解了自花花粉管RNA而抑制了花粉管生長[15]，自花授粉的花粉管在花柱內無法生長，花粉管不能進入胚囊，受精無法完成，致自花授粉不結果。

D組異源花粉強親和性使花粉管生長到達花柱根部的數量較多。B組蜜蜂的授粉時間為1 d，但在花粉柱頭萌發數量、花粉管未受抑制前花粉管的生長上占絕對優勢，由于蜜蜂授粉組試驗授粉樹配置的制約，花粉異質性不足使得大部分生長至花柱中部的花粉管受到抑制，不能到達花柱根部，如果將蜜蜂授粉應用于大田或設施作物授粉，隨著采集花粉異質性的提高，這一問題就會得到解決，授粉效果會得到提高[16-17]。綜合花粉管生長、花粉柱頭萌發2個試驗，蜜蜂授粉組表現出柱頭花粉萌發數量多，花粉管生長較人工授粉組好，蜜蜂授粉效果完全可以取代人工授粉，特別是在授粉樹配置合理情況下，授粉效果會得到有效提升[18]。

3.2 胚、胚乳切片試驗

蘋果是雙受精植物，受精過程中一個生殖核與卵細胞結合，發育成受精胚；另一個生殖核則與2個助細胞結合，發育成為半透明狀的胚乳，作為幼胚發育時的養分，隨著子葉的生長而逐漸消失。蘋果胚珠類型是直立胚珠，胚狀體不同發育時期在形態學上經歷原胚、球狀胚、心形胚、子葉型胚和成熟胚等不同發育階段。

切片較好反映了胚、胚乳的發育過程，對蜜蜂授粉組、人工授粉組、自然授粉及自花授粉的比較得出，授粉后 2，4，6，10，24 h 切片，橢圓形胚囊保持完整，各個組之間的發育差別不明顯。授粉后48，72 h時，珠心細胞解體，D組的解體程度明顯大于B組和N組，在S組中沒有觀察到解體。授粉后13 d，D組水樣狀的胚乳在消失的程度上大于其他2組，說明發育快于其他2組。S組的子房沒有得到受精后生長發育的刺激，花部大部分掉落[19]。

17 d的切片觀察到B，D組的受精合子，沒有在N組中看到這一現象，說明N組發育滯后。授粉后23 d N組觀察到了棒狀胚，B組和D組受精卵開始分裂成小球，此時N組發育較快，是由于被觀察到的這個樣本授粉較早所致。B，D，N組之間差別最大的是在授粉后30 d，D組已經形成了典型的心形胚，而B組心形胚的發育才剛開始，N組只觀察到球形胚。37 d切片觀察，D組發育成子葉型胚，B，N組發育沒有D組完備。47 d時B組和D組已經看到成熟胚，N組只觀察到子葉型胚。

B組在胚、胚乳發育速度上相對D組較慢，這是異源花粉強親和性導致的結果，對比N組的自然授粉，B組還是具有明顯的優勢，說明蜜蜂授粉的花粉親和性比自然授粉組的要強。在23 d時N組的胚發育明顯快于D組和B組，原因是自然授粉中也存在授粉效果較好的現象，但在其他時間段內，N組發育要比其他2組明顯落后。

4 結論

采用蜜蜂授粉，保證了充足的柱頭花粉萌發數量，花粉管生長，胚、胚乳能充分、快速發育，并結合蜜蜂授粉成本低，無農藥、激素污染等優勢，是蘋果無公害生產必須的技術措施之一，使其完全可取代人工授粉[20-21]。另外，蜜蜂授粉在胚、胚乳發育速度上存在的優勢，證明蜜蜂授粉對花部生長發育起到了促進作用，其中深層次的原因有待進一步研究。