甘油激酶的表達純化及在酮糖合成中的應用

吳曉茹， 李子杰， 中西秀樹， 高曉冬

（江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫 214122）

稀有糖的定義是自然界中存在但含量很低的單糖及其衍生物[1]，單糖中如D-阿洛酮糖、D-山梨糖在自然界中含量稀少，屬于稀有糖范疇。單糖衍生物中包括各種單糖對應的糖醇（如木糖醇、山梨糖醇）、環醇、去氧糖（如鼠李糖、巖藻糖）、氨基糖（如葡萄胺）、分支碳鏈糖（如D-芹菜糖）等[2]。稀有糖有很多用途，既可以作為食品添加劑改善其理化性質，還可以作為前體物質來合成具有生物活性的產物，因此稀有糖在食品、醫藥和保健等領域有很大的潛在應用[3-4]，如D-阿洛酮糖具有保護胰腺β島細胞、改善胰島素敏感度和葡萄糖耐受性、減少腹部脂肪積累、清除活性氧自由基等作用，是一種很有前途的無能量的功能性甜味劑[5]，但是目前大部分稀有糖的合成路線仍然有限，并且大多以較昂貴的前體物質進行合成，導致稀有糖的價格還是很高。

在醛縮酶家族中，磷酸二羥基丙酮 （dihydroxyacetone phosphate，DHAP）依賴型醛縮酶的應用最為廣泛[6-7]。該類醛縮酶能催化供體DHAP與受體醛進行縮合反應，生成的產物有兩個新的立體中心，并且一般是由醛縮酶決定立體中心的構型，而不依賴于底物的結構[8]。該類醛縮酶雖然可以接受多種醛分子作為受體，但對供體分子DHAP具有很嚴格的專一性[9]。由于DHAP的價格昂貴且不穩定，很大程度上限制了該酶類大規模的合成應用[10]。目前，最具有應用前景的是將DHAP的酶法合成與醛縮酶催化的縮合反應偶聯。DHAP的酶法合成主要途徑如下：一種是在氧氣存在下，磷酸甘油氧化酶（GPO）氧化L-3-磷酸甘油生成DHAP；另一種是利用甘油激酶或者二羥基丙酮激酶，以二羥基丙酮為底物，ATP為輔助因子來生成DHAP；還有一種就是甘油首先被甘油激酶 （glycerol kinase，GK）磷酸化生成L-3-磷酸甘油，進而被GPO氧化為DHAP。Fessner等人首次建立了“一釜合成法”：首先在氧氣的存在下L-3-磷酸甘油被GPO氧化為DHAP，然后在醛縮酶的催化下，生成的DHAP與醛受體進行縮合反應得到酮糖-1-磷酸，最后在酸性磷酸酶作用下脫去磷酸基團，得到目標糖化合物[11]。在Israel等人的工作中，用二羥基丙酮作為底物，以ATP為輔因子，在二羥基丙酮激酶的作用下生成DHAP，同時在乙酸激酶的催化乙酰磷酸實現ATP的再循環，在FucA醛縮酶的催化下DHAP與各種醛進行縮合反應，所有的反應都在“一釜”里進行[12]。

本研究旨在利用“一釜多酶法”合成策略，進一步降低成本（用便宜的底物代替L-3-磷酸甘油）。本論文中用到的甘油激酶可以催化甘油反應生成L-3-磷酸甘油，在反應中要有Mg2+和ATP的參與[13]。GK酶是甘油代謝過程中的限速酶，1，6-二磷酸果糖（FBP）會抑制該酶的活性[14]。GK是一種常見的酶，可以從不同生物組織中提取得到，目前主要是從大腸桿菌和嗜熱脂肪芽胞桿菌中發酵生產[15]。血清中甘油三酯的含量是臨床上診斷心血管系統疾病的重要指標，甘油激酶是酶法測定血液中甘油三酯的關鍵酶之一[16]。

基于本實驗室前期利用GPO純酶結合DHAP依賴型醛縮酶采用“一釜四酶法”合成稀有糖的基礎[17-21]，本論文中為了進一步降低成本，以甘油作為底物，把甘油激酶用于“一釜多酶法”體系合成包括稀有糖在內的一系列酮糖。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

1.1.1 質粒和菌株 大腸桿菌 MG1655、DH5α和Rosetta（DE3）本實驗室保存。菌株BL21/pET28arhaD、BL21/pET28a-fda、BL21/pET28a-fucA、Rosetta/pET43a-rhaD、Rosetta/pET28a-glpO為實驗室前期構建[17-21]。Rosetta/pET28a-glpK為本實驗所構建。用于基因擴增的引物在華大基因合成。

1.1.2 酶、試劑及耗材 限制性內切酶、DNA連接酶及KOD DNA聚合酶購于TaKaRa公司 （大連）；咪唑購于上海生工；甘油、D-果糖、腺苷-5'-三磷酸二鈉鹽（ATP）購于國藥集團化學試劑有限公司；D-甘油醛（D-glyceraldehyde）購于上海相輝醫藥科技有限公司；過氧化氫酶（catalase）、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷 （IPTG）、 卡那霉素、D-阿洛酮糖 （D-psicose）、D-山梨糖 （D-sorbose）、 酸性磷酸酶（acid phosphatase from sweet potato，AP） 購 于 Sigma-Aldrich；黃素腺嘌呤二核苷酸二鈉鹽水合物購于阿拉??；Ni2+親和層析柱購于GE；BCA蛋白濃度測定試劑盒（加強型）購于碧云天（南通）；氧氣購于新南氣體；Aminex HPX-87H 色譜柱（300×7.8 mm）購于Bio-Rad公司；TLC硅膠鋁板購于青島海洋化工。

1.1.3 培養基及其他溶液配制 YT培養基：胰蛋白胨（tryptone）16 g/L，酵母抽提物（yeast extract）10 g/L，氯化鈉（NaCl）5 g/L，瓊脂（agar）20 g/L（固體培養基），濕熱滅菌（121 ℃，20 min）。

TB 培養基：1.2%（W/V） 胰蛋白胨（tryptone），2.4%（W/V）酵母抽提物（yeast extract），0.4%（V/V）甘油，磷酸鹽緩沖液為17 mM磷酸二氫鉀（KH2PO4），72 mM 磷酸氫二鉀（K2HPO4），濕熱滅菌（121 ℃，20 min）。

用于蛋白純化緩沖液：裂解細胞、平衡緩沖液為 25 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0），150 mmol/L NaCl；洗滌緩沖液為 25 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0），150 mmol/L NaCl，60 mmol/L咪唑；洗脫緩沖液為25 mmol/L Tris-HCl （pH 8.0），150 mmol/L NaCl，500 mmol/L咪唑；脫鹽透析緩沖液為25 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0），50 mmol/L NaCl。

1.1.4 主要儀器 超聲破碎儀（南京新辰生物科技公司）；高效液相色譜儀 （日立）；蛋白純化系統AVANT（AKTA）；iMarK 酶標儀（Bio-Rad）。

1.2 實驗方法

1.2.1 表達載體pET28a-glpK的構建 用KOD聚合酶進行PCR時，以大腸桿菌MG1655菌液為模板，以 glpK-F：5'-CCGGGAATTCATGACTGAAAAA AAATATATCGTTG-3'（EcoRⅠ）為上游引物。以glpK-R：5'-CCCAAGCTTTTATTCGTCGTGTTCTTC CC-3'（HindⅢ）為下游引物，來擴增基因glpK。使用限制性內切酶EcoRⅠ、HindⅢ分別對glpK基因片段和pET-28a質粒進行雙酶切，經DNA連接酶連接后轉化大腸桿菌DH5α，并涂布到YT卡那霉素（50 μg/mL）抗性平板上。挑選單菌落進行PCR鑒定，并提取質粒酶切鑒定，將篩選到的陽性轉化子送至上海華大基因測序，從而得到正確編碼的表達載體pET28a-glpK。

1.2.2 甘油激酶在大腸桿菌中的誘導表達 將重組質粒pET28a-glpK轉化到 Rosetta（DE3）感受態細胞中，轉化步驟同上，涂布到YT（卡那霉素）平板上，37℃過夜培養，然后挑取其中一個單菌落接種到LB（卡那霉素）液體培養基中，37℃過夜培養，取5 mL菌液接種到500 mL TB（卡那霉素）液體培養基中（1∶100），37 ℃振蕩培養，約 3～4 h 后，轉至16℃培養（降溫），當菌體長到OD600約為0.8時，進行IPTG誘導表達（取樣100 μL作為誘導前樣品進行 SDS-PAGE 檢測），然后加入 500 μL IPTG（濃度為100 mmol/L，終濃度為0.1 mmol/L）誘導，在16℃培養20 h后 （取樣100 μL作為誘導后樣品用來SDS-PAGE 檢測），離心收集菌體（8000g，2min，4℃）。

1.2.3 甘油激酶的分離純化 向收集的菌體中加入20 mL預冷的裂解液重懸細胞，置于冰上進行超聲破碎，破碎約 30 min（破碎 5 s，間隔 5 s）后，顯微鏡觀察細胞，直至破碎完成。將破碎好的菌體4℃12 000 g離心30 min，將上清液移到新的離心管中，利用該上清液來純化目的蛋白（上清取樣用來SDS-PAGE檢測），使用蛋白純化系統AVANT（AKTA）用鎳親和層析柱來純化目的蛋白。首先，用平衡緩沖液平衡鎳親和層析柱（5 mL HisTrpTMHP），然后上清液以1.5 mL/min的流速流過鎳柱，上樣完畢后，用洗滌緩沖液洗去非特異性結合的雜蛋白，最后使用洗脫緩沖液洗脫目的蛋白，收集洗脫峰取樣并進行SDS-PAGE檢測。SDS-PAGE檢測后剩余樣品用透析袋（國藥集團化學試劑有限公司）透析以除去高濃度的咪唑，將透析好的目的蛋白用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白濃度。

1.2.4 醛縮酶以及磷酸甘油氧化酶的表達和純化利用本實驗室所保存的質粒，在大腸桿菌中表達純化來源于大腸桿菌和海棲熱袍菌的L-鼠李樹膠糖-1-磷酸醛縮酶RhaD、來源于嗜熱棲熱菌的L-墨角藻糖-1-磷酸醛縮酶FucA、來源于肉質葡萄球菌D-果糖-1，6-二磷酸醛縮酶FruA和來源于肺炎鏈球菌的磷酸甘油氧化酶GPO[17-21]。

1.2.5 利用不同醛縮酶進行一系列酮糖的合成以甘油為前體，用“一釜多酶法”合成策略，進行一系列酮糖的合成。 反應體系如下 （1 mL）：ATP（400 mmol/L，10 μL，4.0 mmol/L），MgCl2（200 mmol/L，10 μL，2 mmol/L），甘油（1 mol/L，25 μL，25 mmol/L），D-甘油醛（0.5 mol/L，50 μL，25 mmol/L），GK 酶（終質量濃度為0.5 mg/mL），磷酸甘油氧化酶GPO（終質量濃度為 0.2 mg/mL），過氧化氫酶（1 000 U，0.2 μL），FAD （68.7 mmol/L，0.2 μL，13.7 μmol/L）， 醛縮酶（RhaDE.coli、FruA、FucA、RhaDT.mari） （ 終 質 量 濃 度 為0.5 mg/mL），補加50 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）緩沖液使反應總體積為1 mL[22]。反應在50 mL的離心管內進行，加入氧氣至飽和，然后蓋上橡膠塞，插入注射器針頭連接一個充氧氣的氣球。

反應液在30℃下輕搖反應約12 h，取1 μL反應液通過TLC來檢測（展開劑為正丁醇∶乙酸∶水=2∶1∶1（V∶V∶V），并使用茴香醛染液進行染色。反應終了后，向反應液中加入6 mol/L HCl調pH為4.6，然后加入 1.2 μL AP，在37℃輕搖反應 12 h，用 TLC來監測反應（展開劑為正丁醇∶乙酸∶水=2∶1∶1（V∶V∶V），反應完全后，用1 mol/L NaOH將pH調整到7.0。

用HPLC來檢測酮糖的合成、產率及比例。HPLC檢測條件如下：流動相為5 mmol/L H2SO4，流速為0.5 mL/min，柱溫為60℃，示差檢測器檢測，進樣量為20 μL。采用相同的HPLC工作條件進行和D-果糖、D-山梨糖、D-阿洛酮糖標準曲線的繪制。

2 結果與分析

2.1 甘油激酶基因的PCR擴增、克隆及鑒定

以大腸桿菌MG1655菌液為模板，擴增出一條約1 509 bp的條帶，與預期的擴增產物大小吻合。按照1.2.1節方法構建重組質粒pET28a-glpK，重組質粒進行酶切驗證，分別用EcoR I單酶切質粒pET-28a和重組質粒pET28a-glpK，用EcoRⅠ、HindⅢ雙酶切重組質粒pET28a-glpK，雙酶切重組質粒得到兩個片段，其中大片段與線性pET-28a大小相當，1 500 bp處有一條帶與glpK基因大小相同，表明重組質粒構建成功，見圖1，測序結果與基因序列完全相同。

2.2 甘油激酶在大腸桿菌中的表達和純化

根據圖2，SDS-PAGE凝膠電泳分析結果顯示，經IPTG誘導后菌體蛋白在約56 kDa處出現一條蛋白條帶（泳道3），與預計大小吻合，未經IPTG誘導的菌體（泳道2）沒有此條帶，說明重組蛋白GK成功表達。同時菌體裂解上清出現清晰的目的蛋白條帶（泳道4），表明重組蛋白GK以可溶性蛋白形式存在。經Ni2+柱純化后的蛋白（泳道5），純度可達90%以上，基本無雜質。從而表明該蛋白可以成功地在上清中表達和純化。

圖1 重組質粒pET28a-glpK的酶切鑒定Fig.1 Restriction enzymatic analysis of recombinant plasmid pET28a-glpK

圖2SDS-PAGE檢測GK的表達與純化Fig.2 SDS-PAGE analysis ofGK expressionand purification

2.3 TLC檢測以甘油為前體的“一釜多酶法”反應

以甘油和D-甘油醛為底物，以ATP為輔助因子，在反應體系中加入GK、GPO和不同的醛縮酶RhaDE.coli、 RhaDT.mari、FucA、FruA 進行反應，反應過程示意如圖3所示。圖4為用TLC檢測的結果，從圖4（a-d）結果可以看出GK酶是可以催化甘油生成L-3-磷酸甘油，同時ATP變為ADP（用綠色箭頭標出），然后在GPO和醛縮酶的作用下生成產物，生成的產物用展開劑展層并用茴香醛染液染色后，能夠檢測到酮糖-1-磷酸的生成，在TLC板上顯示深靛藍色，圖中用紅色箭頭標出，調節pH值到4.7，加入酸性磷酸酶后，比較AP加入前后，可以發現酮糖-1-磷酸被脫掉磷酸生成新的物質酮糖，酮糖用黑色箭頭標出，同時ADP變為AMP（用藍色箭頭標出）。

2.4 HPLC檢測及比例測定

圖3 以甘油作為起始底物通過“一釜多酶法”合成酮糖Fig.3 One-pet multienzymatic synthesis of ketoses with the substrate glycerol

為了進一步確定得到的產物，反應液用HPLC進行檢測，并用D-山梨糖、D-阿洛酮糖和D-果糖標準品溶液，采用相同的HPLC檢測條件，以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線。

圖4 TLC分析酮糖的生成Fig.4 TLC analysis of ketose synthsis

用甘油作為底物，首先利用GK、GPO和RhaDE.coli醛縮酶，以D-甘油醛為受體進行酮糖的合成。與前期結果一致，同時生成了稀有糖D-阿洛酮糖和D-山梨糖，通過HPLC分別測得D-阿洛酮糖的質量濃度為0.26 mg/mL，D-山梨糖的質量濃度為0.20 mg/mL，比例為D-阿洛酮糖/D-山梨糖=1.3/1，產量為0.46 mg，產率為 64%（見液相圖 5（a）和表 1）（甘油和D-甘油醛相對于ATP來說是過量的，產率根據ATP的量計算，理論產生0.72 mg糖類）。為了驗證GK酶與其他的DHAP依賴型醛縮酶是否可以偶聯反應生成不同的產物 （酮糖），在相同的反應條件下，將GK酶分別與 FucA、FruA和RhaDT.mari應用于“一釜多酶法”合成體系中。結果表明，當醛縮酶為FucA以D-甘油醛為受體時，可以得到D-阿洛酮糖/D-山梨糖的比例約為0.4/1，質量濃度分別為0.09 mg/mL和0.25 mg/mL，產量為 0.34 mg，產率為47%（見液相圖 5（b）和表 1）；利用 FruA 醛縮酶，以D-甘油醛作為受體，通過HPLC檢測其只生成D-果糖，說明FruA生成的產物具有很好的專一性，質量濃度為0.53 mg/mL，產率為74%（見液相圖5（c）和表 1）；利用 RhaDT.mari，以 D-甘油醛作為受體，通過HPLC測得D-阿洛酮糖/D-山梨糖的比例約為9/1，質量濃度分別為0.47 mg/mL和0.05 mg/mL，產量為 0.52 mg，產率為 72%（見液相圖 5（d）和表 1）。 由此可知大腸桿菌來源的GK可以用甘油做底物，應用于“一釜多酶法”酮糖合成體系中，并且具有較高的活性，為該法進一步用于其他酮糖（如塔格糖等）及其衍生物的合成提供依據。

圖5 HPLC分析酮糖的生成、比例及產率Fig.5 HPLC analysis of ketoses synthsis

表1 GK酶與不同醛縮酶的催化反應匯總表Table 1 Summary of GK and aldolases catalyzed reactions

3 結語

本研究成功地在大腸桿菌Rosetta（DE3）中表達、純化了GK酶。在實驗室前期工作的基礎上，為避免在羥醛縮合反應中直接使用昂貴且不穩定的底物DHAP，以便宜的底物甘油作為前體物質，將GK成功應用于稀有糖的“一釜多酶法”合成中，并且具有較高產率，但仍需進一步降低成本，稀有糖的大量合成還有待于投入到真正的產業化研究中。