川崎病患兒外周血Th17細胞、γδT17細胞的變化及意義的研究＊

劉志強，彭宇，鄒崢，柯江維

(江西省兒童醫院，南昌 330006)

川崎?。↘awasaki disease，KD）又稱為皮膚黏膜淋巴結綜合征 （mucocutaneous lymphnode syndrome，MCLS），臨床上以持續性發熱、口唇潮紅、球結合膜充血、手足硬腫脫屑等皮膚、黏膜、淋巴結的炎性癥狀為主要表現。KD是一種自限性的以全身性血管炎為主要病理改變的疾病，5歲以下小兒最常見于，多數預后良好，部分可導致冠狀動脈受累，大量流行病學資料顯示川崎病引起的心血管系統并發癥已成為發達國家兒童后天性心臟病最主要的病因[1]。KD的病因及發病機制至今尚未完全清楚，近年來研究表明，可能與一種或多種感染原觸發機體的異常免疫應答反應密切相關。IL-17A是一種重要的促炎因子，Th17細胞和γδT17細胞是目前已知的主要的分泌IL-17A的細胞。本研究通過分析KD患兒外周血Th17細胞、γδT17細胞及其產生的IL-17A的變化，探討Th17細胞、γδT17細胞與KD炎癥損傷的關系。

1 材料和方法

1.1 一般資料 選取2015年3月至2017年9月來我院風濕免疫科住院治療的川崎病患兒107例作為病例組，其中男65例，女42例，平均年齡2.7歲。入組標準：符合川崎病或不完全川崎病診斷標準[2]。另選同期來我院門診體檢的健康兒童63例作為對照組，其中男37例，女26例，平均年齡2.9歲。兩組間兒童的性別、年齡比較差異無統計學意義(P＞0.05)。本研究經醫院倫理委員會批準，同時征得家長的同意并簽署知情同意書。

1.2 主要儀器和試劑 TD5A-WS離心機 （湖南賽特湘儀離心機儀器離心機有限公司），FACSCantoⅡ流式細胞儀（美國BD公司），酶標儀（美國賽默飛世爾科技有限公司），洗板機（安圖實驗儀器有限公司），恒溫孵育箱（美國賽默飛世爾科技有限公司），PE anti-human TCRγδ （美國 BD 公司），Alexa Fluor 488偶聯 anti-human IL-17A McAb（美國BD公司），PerCP anti-human CD3 McAb （美國BD公司），PE anti-human CD4 McAb （美國BD公司），Human IL-17A ELISA Kit(杭州聯科生物科技股份有限公司)。

1.3 研究方法

1.3.1 外周血Th17細胞、γδT17細胞的分析 所有研究對象入院時采集靜脈血2ml，肝素抗凝，用淋巴細胞分離液出單個核細胞(PBMCs)，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養液調整細胞密度為2×106/ml，取1ml細胞懸液鋪至24孔細胞培養板，每孔加入豆蔻酰佛波醇乙酯(終濃度50ng/ml)、離子霉素(終濃度 1μg/ml)及莫能菌素(終濃度10μg/ml)吹打混勻，置于37℃、5%CO2條件下細胞培養箱內培養5h。收集培養后的各組細胞于流式上樣管中，1000r/min離心5min，洗滌后用PBS重懸。取30μl細胞懸液加入到一流式上樣管中，分別加入PerCP anti-human CD3 McAb及PE anti-human TCRγδ各 5μl進行胞外染色，另取 30μl細胞懸液加入到另一流式上樣管中，分別加入PerCP antihuman CD3 McAb及PE anti-human CD4 McAb各5μl進行胞外染色，室溫避光孵育20min；PBS洗滌后加入細胞固定劑和破膜劑，加入Alexa Fluor 488偶聯anti-human IL-17A McAb，室溫避光孵育20min，PBS洗滌后加500μl PBS重懸細胞，同時設立陰性對照和同型對照組；流式細胞儀檢測，所有數據采用FACSDiva軟件分析。

1.3.2 血清IL-17A測定 所有研究對象入院時用普通管采集靜脈血1ml，3000r/min離心3min分離后得到血清，放-80℃冰箱保存，采用酶聯免疫吸附法檢測血清IL-17A表達水平。嚴格按照試劑盒步驟要求進行操作，制作標準曲線，測算標本的OD值所對應的濃度值進行數據統計。

1.4 統計分析 采用SPSS 19.0軟件進行統計分析，結果用均數±標準差表示，組間差異采用單因素t檢驗，P＜0.05表示差距有統計學意義。

2 結果

2.1 病例組和對照組外周血 γδT、γδT17、Th17、Th細胞含量的比較 γδT、γδT17、Th17細胞在病例組外周血CD3+T細胞中的比例 (11.94±2.37、3.71±1.66、1.82±0.66)顯著高于對照組(7.01±0.61、1.22±0.51、0.62±0.28)（P＜0.05），Th 細胞在病例組外周血CD3+T細胞中的比例（63.25±9.96）與正常對照組比例（61.98±2.77）相比無統計學差異（P>0.05）。 見表1。

表1 病例組和對照組γδT、γδT17、Th17、Th細胞含量的比較（x±s）

2.2 病例組和對照組血清IL-17A含量的比較IL-17A 在病例組血清中的含量（11.26±3.51ng/l）顯著高于對照組中的含量 （4.39±1.07ng/l）（P＜0.05）。見表2。

表2 病例組和對照組外周血IL-17A水平比較（x±s）

3 討論

根據TCR不同，T細胞可分為αβT細胞和γδT細胞兩大類。 αβT細胞（包括 CD4+、CD8+T細胞）是參與適應性免疫應答的主要T細胞群體，約占CD3+T細胞的90%～95%。γδT細胞（CD4-T細胞）是一類重要的固有免疫細胞，其百分數僅為CD3+T細胞的1%-10%，與αβT細胞不同，γδT細能更快地啟動宿主體內免疫應答。αβT細胞的TCR識別抗原是主要組織相容性復合體(major histocompatibility-complex，MHC)類分子限制性。 而人的γδT細胞不表達譜系標記，對抗原的識別也無需MHC分子的輔助，即無MHC限制性。

γδT細胞具有各種生物學效應，其主要的效應特點是溶解靶細胞的細胞毒活性和分泌不同種類的細胞因子和趨化因子。γδT細胞還被認為是偶聯固有免疫和適應性免疫的橋梁，與NK細胞、樹突狀細胞等免疫細胞共同構成機體抵抗病原微生物的第一道防御屏障[3]。γδT細胞作為免疫反應早期IL-17A的最重要來源，因其在多種感染性疾病和自身免疫性疾病中發揮重要作用而備受關注。研究發現，HIV感染疾病快速進展者中，VδT細胞的比例顯著增高，并引起HIV感染者CD4+T細胞減少，進而加速疾病進展[4]。劉紅利等[5]研究發現，橋本甲狀腺炎患者的γδT細胞通過表達共刺激分子CD40L和ICOS為B細胞提供協同刺激信號輔助其產生抗體，提示γδT細胞在橋本甲狀腺炎的發病機制中可能發揮著重要作用。Daguzan等[3]發現巨細胞病毒感染后，γδT細胞在數目明顯增多，提示巨細胞病毒感染影響和改變了T細胞亞群的分布。本研究結果顯示，與健康對照組相比，KD患兒γδT細胞的比例顯著增加，而Th細胞無明顯差異?；仡櫥純翰∈?，患兒集中在發熱持續3-5d就診，尚處于疾病早期，而γδT細胞是一類重要的固有免疫細胞，它們能更快地（數小時內）啟動宿主體內免疫應答，且只需少量細胞就能發揮重要作用。因此我們認為KD患兒發病早期γδT細胞發生了高度活化，γδT細胞參與了KD早期的炎癥反應。

IL-17A是一種促炎因子，主要由T細胞誘導合成，是T細胞誘導的炎性反應的早期啟動因子，能夠募集中性粒細胞，促使T細胞激活，還可以促使上皮細胞、內皮細胞合成和分泌IL-6、IL-8等刺激因子，加重局部炎癥反應[6]。王振杰等[7]研究發現風濕免疫相關性血細胞減少癥患者血清中IL-17、IL-12表達水平均高于正常對照組人員；提示介導自身免疫的IL-17等炎性因子表達水平和風濕免疫相關性血細胞減少癥患者的造血細胞炎性受損相關病變過程關系密切。帥可鑫等[8]對過敏性紫癜患兒隨訪時發現復發組患兒血清IL-17明顯高于非復發組，提示IL-17可以用來檢測過敏性紫癜患兒病情。劉嵐等[9]亦研究發現IL-17可能參與了巨細胞病毒性肝炎的發病過程，在病毒性肝炎的發病過程中具有重要的臨床意義。本研究發現，與健康對照組相比，KD患兒血清IL-17A的含量顯著增加，高水平IL-17A與KD的發病密切相關。IL-17A作為促炎因子參與了KD發生，對其濃度進行檢測，可以為KD的炎癥干預提供有效依據。

Th17細胞是近年發現的一類T細胞亞群，可通過分泌 IL-17 （IL-17A）、IL-17E、IL-6、IL-21 等來促進自身免疫性炎癥疾病的發生和發展[10]。一直以來Th17細胞被認為是IL-17A的主要來源。苗靜[11]等研究發現，過敏性紫癜患兒急性期血漿IL-17水平增高，Th17細胞功能增強；Th17細胞和IL-17共同參與兒童過敏性紫癜的發病機制。然而進一步研究發現Thl7細胞的作用機制并不能解釋宿主免疫早期起重要作用的IL-17的產生?，F在已知產生IL-17A的適應性免疫細胞主要包括Th17細胞和Tc17細胞[12]；產生IL-17A的固有樣淋巴細胞主要包括γδT細胞和NKT細胞，其中γδT細胞產生IL-17A的數量甚至超過Th17細胞[13]。在過敏性哮喘患者的γδT細胞中IFN-γ+/IL-17A+比例大幅度降低[14]，說明γδT細胞可能通過分泌IL-17A細胞因子參與哮喘的發病。薛春雪等[15]研究發現，γδT細胞有可能以γδTCR非依賴的作用方式活化，并通過釋放IL-17A參與H1N1重癥感染小鼠早期肺組織炎性損傷過程。徐玲[16]等研究亦發現，巨細胞病毒感染組IL-17水平較對照組升高，其表達水平與γδT細胞表達呈正相關，提示γδT細胞可能也參與了巨細胞病毒感染患兒IL-17的產生。我們研究發現，相對于健康對照組，γδT17細胞和Th17細胞比例在病例組中明顯升高，表明γδT17細胞和Th17細胞均參與了KD早期的炎癥反應。有研究表明，當有炎性因子存在時，Th17細胞由CD4+T淋巴細胞分化，并促進細胞因子IL-17的產生，這類炎癥因子主要是轉化生長因子(TGF-β）[17]。歷風元等[18]研究發現慢性阻塞性肺疾病模型組肺組織中TGF-β1的含量較對照組肺組織明顯升高。Peters等[19]在研究肺纖維化時證實IL-17通過誘導TGF-β和膠原蛋白產生直接促進肺纖維化。因此，我們認為Th17細胞的增多可能是因為γδT17細胞產生的IL-17A通過TGF-β對其的趨化募集作用所致[20]。

雖然對IL-17A研究主要集中在Th17細胞，但是γδT細胞及其分泌的IL-17A在炎癥反應方面的作用越來越受重視，至今它們在兒童KD中的作用尚未完全明確。今后應進一步深入研究Th17細胞和γδT細胞及IL-17A在兒童KD中的發病機制，為臨床炎癥干預和開發新藥提供理論依據。