防腐生肌膏對基質金屬蛋白酶變化的影響

李叔洪，姜曉文，辛 秀，于文會

(東北農業大學動物醫學學院，黑龍江哈爾濱 150030)

創傷愈合是一個復雜的過程[1]。創面愈合過程中，遷移增生的平滑肌細胞和成纖維細胞，分泌的細胞外基質起到重要作用，它可以為細胞提供移動的網絡和向導，把細胞黏附在一起，對組織的愈合起到骨架作用，并且影響各種生長因子生物活性及其調節作用[2]。Ⅰ型膠原是細胞外基質的重要成分之一，主要起到支架的作用，與皮膚的張力大小有關，Ⅲ型膠原則決定膠原纖維的直徑的大小和彈性的好壞[3]。Ⅲ型膠原含量越高、越細，彈性越好，形成的瘢痕越輕，所以提高Ⅲ型膠原的比例，對于創傷愈合質量是很重要的[4]。

基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)是一個需要Ca2+、Zn2+等金屬離子作輔助因子的大家族，目前MMPs家族已分離鑒別出20多個的成員，分別為MMP1-20等[5]，其主要生理作用是降解細胞外基質。在創傷愈合的早期，MMPs可以降解細胞外基質中的膠原肽段，并產生趨化因子，加速炎性細胞的吞噬作用，對于炎性反應區的清潔有著重要的作用[6]。其中，MMP-1和膠原有密切的相關性[7]，可以分解創面膠原，減少創面膠原的大量表達聚集，使膠原的合成和分解處于平衡狀態，特別是對創面Ⅰ、Ⅲ型膠原的降解起關鍵作用，在創面愈合中組織重塑階段起到極其重要的作用。MMP-2在酶解細胞間基質成分及基底膜的主要成分Ⅳ型膠原中有“鉆頭”的作用，在創傷愈合早期瘢痕組織、肉芽組織形成中發揮作用。MMP-9也稱為明膠酶B，它可參與創傷修復過程的幾個早期步驟，參與細胞外基質的降解，對Ⅰ型前膠原的合成物有明顯的影響，在促進創傷愈合中主要起到延長組織重塑的作用[8]?；|金屬蛋白酶抑制劑(tissue inhibitor of matrix metalloproteinases，TIMPs)是MMPs的內源性特異性抑制因子,有4種類型，分別為TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3和TIMP-4。其中，TIMP-1可以特異性地與MMP-1和MMP-9結合從而抑制其表達[9]，TIMP-2是MMP-2的特異性抑制劑，可以有效的抑制MMP-2的活性[10]，這種相互作用在創傷愈合的過程中促進了創面組織中膠原的降解，防止創面膠原過度沉積導致瘢痕形成[11-12]。

防腐生肌膏是由血竭、乳香、沒藥、紫草、三七等中藥組成制備的油膏。本方是在傳統防腐生肌散原方的基礎上，經過篩選、優化制備而成的外用治療創傷愈合的膏劑。本試驗就是應用制備好的防腐生肌膏作用于大鼠的皮膚破損模型，觀察防腐生肌膏對創面肉芽組織中基質金屬蛋白酶及其組織抑制劑表達量的測定，來闡明防腐生肌膏在創傷愈合過程中的作用機理。

1 材料與方法

1.1 材料

SD大鼠50只，雌雄各半，體重200 g±20 g，購自哈爾濱漢方實驗動物繁殖中心；防腐生肌膏主要由血竭、乳香、沒藥、三七、紫草、黃柏、冰片(哈爾濱市藥材公司產品)組成，由東北農業大學中獸醫學實驗室制備；大鼠MMP-1 ELISA試劑盒、大鼠MMP-2 ELISA試劑盒、大鼠MMP-9 ELISA試劑盒、大鼠TIMP-1 ELISA試劑盒、大鼠TIMP-1 ELISA試劑盒，上海北諾生物科技有限公司產品。

1.2 方法

1.2.1 動物皮膚缺損模型的制備及給藥方法 健康SD大鼠50只，常規飼養，7 d后開始造模。造模前用犬眠寶麻醉大鼠，麻醉后的大鼠俯臥固定，背部正中左右兩側距脊柱1 cm處各選擇1塊5 cm×5 cm的完整皮膚，100 g/L硫化鈉脫毛處理，生理鹽水清洗擦干局部涂抹碘酊進行消毒，選用自體對照法，在大鼠背部設定皮膚右側為防腐生肌膏組，左側為空白對照組，在脫毛處剪成2 cm×2 cm的傷口，深達肌筋膜，大鼠分籠進行飼養，并給以充足的水和食物。防腐生肌膏組的創面每天進行常規消毒，涂抹防腐生肌膏，厚度約2 mm，每天1次，至完全愈合；空白對照組的創面每日常規消毒，涂抹20 g/L碘酊[13]。

1.2.2 樣品采集 造模后第3、7、10、14天，隨機選取每組各10只大鼠取樣，使用乙醚麻醉，剪刀剪取大鼠創面中心至創緣正常皮膚間的新生的肉芽組織部分，約0.5 cm2，置-80℃冰箱中保存。

1.2.3 檢測指標及方法 將采集的樣本與PBS 1∶9進行研磨，3 000 r/min離心20 min，取上清，分裝后置于-20℃備用。采用ELISA檢測上清中的 MMP-1、MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2的含量，重復3次[14]。

2 結果

2.1 防腐生肌膏對創面組織表達MMP-1調節

創傷后第1天，防腐生肌膏組與對照組創面都開始表達MMP-1，兩組比較差異不顯著(P>0.05)。創傷后第3天，防腐生肌膏組創面MMP-1的表達量最高，與對照組差異顯著(P<0.05)。創傷后第7天、第10天、第14天，隨著創傷時間延長表達量逐漸減弱，且防腐生肌膏組創面MMP-1表達量極顯著高于對照組(P<0.01)(圖1)。

與對照組相比較，**代表差異極顯著(P<0.01)，*代表差異顯著(P<0.05)

** represents extremely significant difference (P<0.01),* shows significant difference (P<0.05),compared with the control group

圖1防腐生肌膏對創面MMP-1表達的影響

Fig.1 Effect of Fangfu Shengji ointment on the expression of
MMP-1 in the wound

2.2 防腐生肌膏對創面組織表達MMP-2調節

創傷后第1天，防腐生肌膏組與對照組開始表達MMP-2，兩組差異不顯著；創傷后第3天、第7天防腐生肌膏組創面MMP-2表達量逐漸增加，第10天達到高峰，之后開始減弱；創傷后第10天、第14天，表達量與對照組比較差異極顯著(P<0.01)(圖2)。

與對照組相比較，**代表差異極顯著(P<0.01)

** represents extremely significant difference (P<0.01)

圖2防腐生肌膏對創面MMP-2表達的影響

Fig.2 Effect of Fangfu Shengji ointment on the expression
of MMP-2 in the wound

2.3 防腐生肌膏對創面組織表達 MMP-9 調節

創傷第1天，防腐生肌膏組與對照組都開始表達MMP-9，隨著創傷時間延長，在創傷后第3天達到表達高峰，之后逐漸減弱。防腐生肌膏組與對照組比較，防腐生肌膏能極顯著促進創面表達MMP-9(P<0.01)(圖3)。

2.4 防腐生肌膏對創面組織表達 TIMP-1 調節

創傷開始后，創面就開始表達TIMP-1，隨著創傷時間延長，防腐生肌膏組與對照組比較，TIMP-1的表達量逐漸減少，并且極顯著低于對照組(P<0.01)(圖4)。

與對照組相比較，**代表差異極顯著(P<0.01)

** represents extremely significant difference (P<0.01)

圖3防腐生肌膏對創面MMP-9表達的影響

Fig.3 Effect of Fangfu Shengji ointment on the expression
of MMP-9 in the wound

與對照組相比較，**代表差異極顯著(P<0.01)

** represents extremely significant difference (P<0.01)

圖4防腐生肌膏對創面TIMP-1表達的影響

Fig.4 Effect of Fangfu Shengji ointment on the expression
of TIMP-1 in the wound

2.5 防腐生肌膏對創面表達 TIMP-2 調節

創傷開始后，創面就開始表達TIMP-2，隨著創傷時間延長，防腐生肌膏組與對照組比較，TIMP-2表達量逐漸減少，并且極顯著低于對照組(P<0.01)(圖5)。

與對照組相比較，**代表差異極顯著(P<0.01)

** represents extremely significant difference (P<0.01)

圖5防腐生肌膏對創面TIMP-2表達的影響(ng/mL)

Fig.5 Effect of Fangfu Shengji ointment on the expression
of TIMP-2 in the wound(ng/mL)

3 討論

創傷發生后，肉芽組織的快速生長能夠促進創傷愈合。肉芽組織主要成分為膠原，主要包括Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原?；|金屬蛋白酶和基質金屬蛋白酶抑制調控膠原劑的合成與分解。因此，在創傷修復過程中，基質金屬蛋白酶和基質金屬蛋白酶抑制在組織中的含量變化，體現了膠原在創口中的積累，代表創口填充的快慢。在創傷修復中，基質金屬蛋白酶MMP-1、MMP-2、MMP-9促進膠原的分解，而基質金屬蛋白酶抑制劑TIMP-1、TIMP-2抑制基質金屬蛋白酶的活性。因此，檢測MMP-1、MMP-2、MMP-9與TIMP-1、TIMP-2含量變化，可以推知膠原在傷口的積累情況。

試驗結果顯示，創傷第1天，防腐生肌膏組與對照組創面都開始表達MMP-1、MMP-2、MMP-9及TIMP-1、TIMP-2，這主要是因為創傷早期成纖維細胞及各種炎性細胞開始分泌一定量的MMP和TIMP，目的為抑制早期的炎癥反應。隨著創傷時間的延長，創傷后第3天，防腐生肌膏組創面MMP-1的表達量達到最高，之后表達量逐漸減少；MMP-2的表達量隨創傷時間逐漸增加，第10天達到高峰，之后開始減弱；MMP-9的表達量創傷后第3天達到表達高峰，之后逐漸減弱。從三者的表達量看，防腐生肌膏組均高于對照組，且差異顯著。研究發現，血竭中的血竭素高氯酸鹽對瘢痕成纖維細胞的增殖具有顯著的抑制作用，且呈劑量依賴性降低Ⅰ、Ⅲ型前膠原的表達而抑制成纖維細胞合成膠原促進成纖維細胞發生凋亡[15]。血竭為防腐生肌膏中的主要藥物，試驗中防腐生肌膏通過提高MMP-1、MMP-2及MMP-9的表達促進Ⅰ、Ⅲ型膠原降解來調節創面愈合防止瘢痕組織形成的結果相一致。Krieglstein C F等[16]研究發現，對試驗性腸炎模型的SD大鼠，乳香提取物和11-羰基-β-乙酰乳香酸單體均可以明顯減輕組織損傷程度，具有抗炎作用。組方中乳香、沒藥的配伍從中醫理論的角度理解，其所涵蓋的藥物相互作用表現為同氣相求，現代研究也發現，兩藥配伍的藥效作用通常呈現為藥理作用的協同增效[17]。另外，方中紫草的活性成分也具有抗炎作用[18]。而方中三七中的活性成分對瘢痕成纖維細胞增殖有抑制作用[19-20]，縮小瘢痕組織，提高傷口愈合質量。防腐生肌膏方中諸藥的共同作用下，調節膠原代謝，促進組織愈合，減少瘢痕產生。

防腐生肌膏能通過促進創傷愈合的一個重要機制是通過調控MMP-1、MMP-2、MMP-9與TIMP-1、TIMP-2的活性，調節膠原代謝，促進創傷愈合。