大腸桿菌合成琥珀酸的代謝工程研究進展

白家齊,孟 嬌,韓北忠,陳晶瑜*

(中國農業大學 食品科學與營養工程學院,北京 100083)

琥珀酸(succinic acid)學名丁二酸,屬于四碳二羧酸家族的一員,廣泛地存在于動物、植物和微生物中[1]。琥珀酸及其衍生物被廣泛地應用于食品,制藥和化妝品等領域。琥珀酸的發酵潛力早在1980年就得到認可,在美國能源部公布的12種有潛力可大宗生產的化合物中,琥珀酸居于第一位[2],目前生產琥珀酸的方法主要有化學法和生物法,其中化學法仍然是琥珀酸生產的主要方法[3]。但是化學法生產的過程中污染大、成本高,不符合如今倡導的可持續發展原則,生物發酵法生產琥珀酸因具有資源可再生及吸收CO2等優點而擁有廣闊的發展潛力。

琥珀酸鹽作為三羧酸循環(tricarboxylicacidcycle,TCA)中的中間體之一,可以由許多微生物合成:產琥珀酸放線桿菌(Actinobacillus succinogenes)[4],產琥珀酸厭氧螺菌(Anaerobiospirillum succiniproducens)[5],谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)[6],釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)[7],大腸桿菌(Escherichia coli)等,由于生長速度快,基因信息清楚,基因操作簡單,營養需要量極小,大腸桿菌已被廣泛研究用于琥珀酸的生產[8]。

為了提高大腸桿菌產琥珀酸的能力,研究人員已經探索了多種代謝工程策略[9-11],如激活糖酵解途徑(embden meyerhof pathway,EMP)、過表達丙酮酸代謝酶、消除競爭途徑、并提供還原當量和能量等[12-15]。本文介紹代謝控制發酵產琥珀酸方面的研究進展,以期對今后的發展提供新思路。

1 消除競爭途徑

1.1 敲除競爭性副產物

如圖1所不,在厭氧條件下,大腸桿菌進行混合酸的發酵,生成大量的乙酸、乳酸、甲酸和乙醇,乃積累少量的琥珀酸。這些副產物的生物合成不僅消耗碳源,而且還消耗限制琥珀酸生產的煙酰胺腺嘌吟二核苷酸(nicotinamide adeninedinucleotide,NAD+)。因此,大腸桿菌的代謝工程必須關注阻斷副產物生物合成途徑[6]。JANTAMA K等[16]以KJ091為出發菌株敲除tdcD(編碼蘇氨酸脫羧酶)和tdcE(編碼2-酮丁酸甲酸裂解酶)后,乙酸的含量減少了50%,琥珀酸的得率達到1.3 mol/mol。在此基礎上,接著敲除aspC(編碼天冬氨酸轉氨酶)和sfcA(編碼NAD+依賴的蘋果酸酶),琥珀酸的產量和得率分別提高至700 mmol/L和1.5 mol/mol。

圖1 厭氧條件下大腸桿菌生物合成琥珀酸的代謝途徑Fig.1 Metabolic pathways of succinate biosynthesis in E.coli under anaerobic conditions

1.2 失活磷酸烯醇式丙酮酸轉運系統

磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvate,PEP)是合成許多工業化學物(如琥珀酸,蘋果酸和芳香族化合物)的重要前體物。然而在大腸桿菌中,葡萄糖主要是通過磷酸烯醇式丙酮酸轉運系統(phosphoenolpyruvate transport system,PTS)運輸到細胞質中,其中有一半的PEP被用于葡萄糖的攝取和磷酸化。失活PTS系統,提高PEP前體物的供給,是提高代謝流通向目標產品琥珀酸的重要代謝工程策略。然而,PTS突變的菌株在生長和糖耗方面表現得非常緩慢,這樣的發酵特點不適用于大規模的工業化生產。ptsG基因突變的菌株PB11通過代謝進化后提高了糖耗的速率,研究發現半乳糖透性酶-葡萄糖激酶(galactose permease-glucokinase,Galp-Glk)轉運系統成為了該菌株葡萄糖的攝取和磷酸化的主要途徑[17]。TANG J等[18]在菌株XZ-T108(ΔptsI ΔldhAΔpflB,Pck)中組合調控大腸桿菌自身的galp(編碼半乳糖透性酶)和glk(編碼葡萄糖激酶)后,葡萄糖的利用率得到了提高,琥珀酸的產量從156mmol/L提高至187mmol/L,生產速率從0.19 g/(L·h)提高至0.22 g/(L·h)。

2 過表達自身或外源的關鍵酶

2.1 過表達內源羧化酶

在PEP下游有兩種代謝途徑:通過固定一個分子的CO2,PEP(C3)可以轉化為草酰乙酸(oxaloacetate,OAA)(C4),并且草酰乙酸進一步轉化為琥珀酸;PEP也可用于生產丙酮酸鹽,導致副產物乙酸鹽,甲酸鹽,乙醇和乳酸鹽的形成。因此,C4化合物的合成對琥珀酸生產是重要的。大腸桿菌自身有4種羧化酶:磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase,PPC)、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase,PCK)和兩種蘋果酸酶(malic enzyme,Mae)A和B。MILLARDCS等[19]在菌株JCL1208的基礎上,采用誘導型質粒過表達大腸桿菌自身的PPC,PPC酶活力提高了8.57倍,琥珀酸的轉化率和產量分別提高了3.75和3.50倍;相反,過表達大腸桿菌自身的PCK則對琥珀酸產量沒有明顯的提高。STOLSL等[20]在NZN111菌株中過表達大腸桿菌本身的MaeA,琥珀酸的產量較出發菌提高了6倍。在菌株K-12中過表達自身MaeB,使得重組大腸桿菌的琥珀酸產量提高至15.4mmol/L,比出發菌株增強了1.4倍[21]。TAN Z等[22]通過組合優化PPC和PCK兩個酶的表達提高了琥珀酸的產量。研究發現,PCK的活力和琥珀酸的產量有正相關性,而PPC乃有在特定的酶活力范圍內PPC活力和琥珀酸的合成呈正相關性,超過這個界定范圍,細胞的生長和琥珀酸的形成就會顯著下降。通過對PPC和PCK的組合優化,最優菌株琥珀酸的產量提高了近70倍,琥珀酸的得率達到了1.12 mol/mol。

2.2 過表達外源羧化酶

現有的文獻報道中,被研究最多的外源羧化酶就是丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase,PYC)和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase,PCK)。雖然在大腸桿菌中PCK催化的反應主要是糖異生,但是在一些高產琥珀酸的瘤胃細菌里PCK卻是主要的羧化酶。厭氧條件下,葡萄糖經EMP途徑再經TCA還原臂生成琥珀酸的途徑中是沒有凈ATP產生的,為了解決厭氧條件下菌體的維持能,引入ATP依賴性的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PCK)成為大腸桿菌主要的羧化酶是一個重要的代謝工程策略。KIM P等[23]在大腸桿菌K-12中過表達來自產琥珀酸放線桿菌的PCK后,琥珀酸的產量并沒有明顯的變化,這可能是由于大腸桿菌自身PPC的高活力所導致的。然而,在PPC突變的菌株中過表達產琥珀酸放線桿菌的PCK后,琥珀酸的產量較出發菌株提高了6.5倍。

3 提高NADH的供給

在厭氧的條件下,一分子葡萄糖經過EMP途徑能產生兩分子的還原型輔酶Ⅰ(nicotinamideadeninedinucleotide,NADH)和兩分子磷酸烯醇式丙酮酸(PEP),然而經TCA還原臂生成一分子琥珀酸則需要一分子的PEP和兩分子的NADH,所以葡萄糖經這條途徑的理論得率乃有1 mol/mol葡萄糖,為了提高NADH的供給,目前以甘油為底物產琥珀酸、激活乙醛酸途徑和表達外源的甲酸脫氫酶已經得到了應用。

3.1 利用甘油為底物產琥珀酸

甘油是生物柴油生產的主要副產品。隨著生物柴油產業的發展,如何將甘油轉化為有價值的產品已成為亟待解決的問題。作為糖異生碳源之一,甘油具有高還原性,因此有利于產生琥珀酸等還原產物。其天然pck基因在雙重突變體大腸桿菌菌株MLB(ΔldhA和ΔpflB)中的過表達顯著提高了甘油利用率和琥珀酸產量。與對照相比,甘油消耗量從2.2 g/L增加至35.8 g/L,琥珀酸產量從2.5 g/L增加至42.5 g/L[8]。BLANKSCHIEN M D等[24]通過代謝工程使得大腸桿菌在微氧下利用甘油產琥珀酸。首先失活競爭途徑的幾個關鍵基因ldhA、adhE和pflB,隨后引入來自乳酸菌的丙酮酸羧化酶(PYC),琥珀酸的產率和得率分別達到了400 mg/(g·h)和0.69 g/g甘油。ZHANGX等[25]在已構建好的產琥珀酸的菌株上,通過失活pflB和ptsI基因,強化pck基因的表達,重組后的菌株利用甘油為底物產琥珀酸,琥珀酸的得率達到了理論最大得率的80%。

3.2 激活乙醛酸途徑

在大腸桿菌的代謝途徑中,有兩條路徑能形成琥珀酸。一條是在完全厭氧的條件下較為活躍的TCA還原臂,另一條則是在好氧條件下較為活躍的乙醛酸支路。乙醛酸循環催化一分子的草酰乙酸和兩分子的乙酰輔酶A形成一分子的琥珀酸和一分子的蘋果酸,生成的這一分子蘋果酸再與一分子的NADH形成一分子的琥珀酸,總得來說,消耗一分子的NADH能形成兩分子的琥珀酸。研究表明,當71.4%的碳流量通向TCA還原臂,28.6%的碳流量通向乙醛酸支路,琥珀酸得率能達到最大理論得率1.714 mol/mol[26]。研究發現,在厭氧條件下敲除乙酸合成基因ackA和pta對激活乙醛酸途徑起到了關鍵的作用。敲除ldhA、ptsG和ackA-pta基因,重組菌株YJ003琥珀酸的產量能達到150.78 mmol/L,相比對照菌株提高了5倍[27]。

3.3 表達外源的甲酸脫氫酶

甲酸脫氫酶能催化一分子的甲酸形成一分子的CO2和一分子的NADH,引入外源的甲酸脫氫酶不僅能為琥珀酸的合成提供額外的還原力,加強琥珀酸的合成能力,同時還能降低副產物甲酸的積累,有助于下游產品的分離純化。BALZERGJ等[28]將假絲酵母中NAD+依賴型的甲酸脫氫酶基因fdh1引入大腸桿菌SBS550MG中,重組后的菌株琥珀酸的產率從1.4 g/(L·h)提高至2 g/(L·h),甲酸從17mmol/L減少至0～3 mmol/L。LITSANOV B等[29]將來自分支桿菌的甲酸脫氫酶基因fdh引入產琥珀酸的谷氨酸棒桿菌中,重組菌株BOL-3/pAN6-gap在以葡萄糖為單一碳源的培養基中發酵培養,琥珀酸的得率達到1.07 mol/mol,當發酵液中添加一定量的甲酸后,琥珀酸的得率提高到1.41 mol/mol。

4 擾動磷酸戊糖途徑(PPP途徑)

磷酸戊糖途徑(pentosephosphatepathway,PPP)途徑產生的還原力是煙酰胺腺嘌吟二核苷酸磷酸(nicotinamide adeninedinucleotidephosphate,NADPH),而琥珀酸的合成則需要煙酰胺腺嘌吟二核苷酸(NADH),通過擾動PPP途徑來提高琥珀酸的生物合成還需要體內轉氫酶的參與,進而實現輔因子NADPH和NADH的相互轉化。在大腸桿菌中存在兩種類型的轉氫酶,它們分別是能量依賴型的膜定位嘧啶核苷酸轉氫酶(PntAB)和非能量依賴型的可溶性轉氫酶(UdhA)。當胞內NADPH的濃度較低時,PntAB催化NADH和NADP+生成NADPH和NAD+,反之,當胞內NADPH的濃度較高時,UdhA則催化NADPH和NAD+生成NADH和NADP+[30]。MENG J等[14]將參與谷氨酸棒狀桿菌產生NADPH的解調基因zwf243(編碼葡萄糖-6-磷酸脫氫酶)和gnd361(編碼6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶)導入大腸桿菌以產生琥珀酸,有益于突變脫氫酶的共表達,其去除了PPP途徑氧化部分中的反饋抑制,將琥珀酸產量從1.01 mol/mol葡萄糖增加至1.16 mol/mol葡萄糖。然后過表達了3個關鍵基因,pgl(編碼6-磷酸葡萄糖酸內酯酶)、tktA(編碼轉酮酶)和talB(編碼轉醛酶)以重定向更多的碳流向PPP途徑,并進一步將琥珀酸得率提高至1.21 mol/mol。

5 強化琥珀酸的輸出

產物的輸出對于提高目標產品的產量和得率是非常重要的。在厭氧條件下,E.coli四碳二羧酸的攝取,運輸和輸出主要是依靠體內的Dcu轉運系統。Dcu轉運系統主要包含4種運輸蛋白,它們分別是DcuA、DcuB、DcuC、DcuD。DcuA和DcuB是兩個同源蛋白,它們能夠獨立地或相互地作用大腸桿菌體內冗余的四碳二羧酸的輸出,研究表明DcuB運輸蛋白的主要功能是催化四碳二羧酸的交換,例如催化延胡索酸轉變為琥珀酸[31],然而DcuA確切的生理功能至今還未見報道。盡管DcuC蛋白能協助DcuA和DcuB蛋白去完成延胡索酸的攝取和延胡索酸與琥珀酸的交換,但是已有報道指出DcuC蛋白的主要功能卻是協助在厭氧條件下以葡萄糖為碳源時琥珀酸的胞內到胞外的輸出[32]。DcuD雖然是DcuC的同源蛋白,但是DcuD在體內大多情況下是不被表達的,所以DcuD的主要生理功能至今也不清楚[33]。CHEN J等[34]以大腸桿菌Suc-T110為出發菌株,首先分別敲除編碼Dcu運輸蛋白的基因,dcuA、dcuB、dcuC、dcuD,結果發現敲除dcuA和dcuD基因后,琥珀酸的產量和得率幾乎沒有變化。敲除dcuB和dcuC基因后,琥珀酸的產量分別下降了15%和11%。然而,同時敲除dcuB和dcuC這兩個基因后,琥珀酸的產量下降了90%。該研究表明當以葡萄糖為單一碳源時,DcuB和DcuC是大腸桿菌體內琥珀酸胞內到胞外輸出的兩個關鍵蛋白。隨后,對DcuB和DcuC這兩個運輸蛋白的RBS進行組合優化,琥珀酸的產量從273 mmol/L提高至366 mmol/L,琥珀酸的得率從1.12 mol/mol提高至1.41 mol/mol。

6 代謝進化

代謝進化作為一種有價值的方法已經被廣泛用于菌株發育和優化,這不僅可以導致潛在途徑的激活,而且還會導致突變株的期望表型和環境適應性的改善[35]。JANTAMA K等[36]在野生型的E.coli ATCC 8739的基礎上,結合代謝工程和代謝進化,篩選到琥珀酸生產最優的兩株菌KJ060(ΔldhAΔadhEΔackAΔfocA ΔpflB)和KJ073(ΔldhAΔadhE ΔackAΔfocAΔpflBΔmgsAΔpoxB),在以葡萄糖為單一碳源時,琥珀酸的產量達到622～733 mmol/L,得率達到1.2～1.6 mol/mol。ZHU X等[37]通過代謝進化得到一株高產琥珀酸的菌株HX024,在以基本鹽為培養基時該菌株琥珀酸的產量達到了813 mmol/L,琥珀酸的得率達到1.36 mol/mol。通過全基因組測序,轉錄組學及酶學的分析,lpdA基因中有三個核苷酸的突變,該基因的突變解除了丙酮酸脫氫酶對NADH的抑制作用,丙酮酸脫氫酶的活力提高,提供更多NADH用于琥珀酸的合成。除此之外,磷酸戊糖途徑中的轉酮酶(TktA)以及轉氫酶(SthA)的活力也得到了相應的提高。結合逆向代謝工程,在野生型的大腸桿菌中過表達磷酸戊糖途徑中的tktA及sthA,琥珀酸的得率從1.12mol/mol提高到1.33 mol/mol。

7 展望

控制微生物代謝發酵來生產琥珀酸有著不可替代的優勢,另外產品更加適用于食品、醫藥、農藥等與人類健康密切相關的行業,具有巨大的生產潛力,目前為止通過多種基因策略來提高琥珀酸生物合成的嘗試是成功的,但是仍然達不到工業化大生產所需要的效率和強度,為了能夠實現琥珀酸生物合成工業化,依然需要深入研究大腸桿菌琥珀酸代謝途徑、過表達關鍵酶、強化輸出、代謝進化等,綜合利用強化琥珀酸合成途徑來構建新的產琥珀酸途徑,開發出具有產業化前景的產琥珀酸基因工程菌株,同時隨著系統生物學、分子生物學技術等的不斷發展,琥珀酸的生物合成定會充分體現出環境和經濟效益,也將推動發酵產琥珀酸的產業化,生產出更具優勢的琥珀酸產品。