中國實驗動物中結腸小袋纖毛蟲快速鑒定及感染調查

高正琴

(中國食品藥品檢定研究院，北京 100050)

新出現的原生動物病原體已經成為人類健康的主要威脅。在過去的二三十年里，導致人類疾病的原生動物病原體的數量一直在上升。免疫缺陷患者數量的顯著增加、國際旅行的增加、森林砍伐和廣泛的城市住所是導致原生動物疾病流行病學變化的一些因素。結腸小袋纖毛蟲是引起痢疾的重要原因，特別是在免疫系統受損的人群中，結腸小袋纖毛蟲可能成為一種重要的病原體。結腸小袋纖毛蟲(balantidiumcoli)寄生于宿主結腸，感染引起結腸小袋纖毛蟲病(balantidiosis)，呈世界性分布，主要流行于熱帶和亞熱帶地區，大多數人類病例都來自南美和中美洲、中國、伊朗、印度尼西亞、菲律賓、新幾內亞和太平洋島嶼。目前已知包括人在內的多種動物如豬、猩猩、猴、大鼠、豚鼠、馬、牛、羊、鴕鳥、鷹等均可感染，感染的范圍從無癥狀、輕微腹瀉到血糞和暴發性痢疾。在急性疾病中，可能每20 min就發生一次暴發性腹瀉。在極少數情況下，結腸小袋纖毛蟲也會侵犯其他器官，這在免疫缺陷患者中更常見[1～12]。

目前，國內實驗動物的結腸小袋纖毛蟲感染概況在很大程度上是未知的。至今尚未見不同方法檢定實驗動物結腸小袋纖毛蟲的具體研究及感染報道。本研究首次采用實時動態顯微技術(real-time dynamic microscopy technique)和聚合酶鏈反應(polymeras chain reaction，PCR)及測序技術(sequencing technique)，對國內實驗動物的結腸小袋纖毛蟲進行快速檢定和感染調查，為國家標準的修訂提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 研究對象 2012年12月～2017年12月，14 964只表觀健康的實驗動物(包括：猴382只，小型豬725只，犬806只，兔1 517只，地鼠422只，豚鼠1 545只，大鼠1 489只，小鼠8 053只，雞25只)來自全國60個不同廠家。猴、小型豬、犬、兔、雞采集新鮮糞便。豚鼠、地鼠、大鼠、小鼠安樂死后采集腸道內容物[13，14]。

1.2 試劑和儀器 QIAamp DNA Stool Mini Kit，QIAamp DNA Mini Kit為德國Qiagen公司產品；nuclease-free water為美國Progema公司產品；DNA Marker，Agarose，EX Taq，dNTP Mixture為日本TaKaRa公司產品。顯微鏡及成像系統(Nikon，日本)；Gel Logic凝膠成像分析系統(東樂自然基因生命科學公司)；Verity 96 Thermal Cycler基因擴增儀(Applied Biosystyem，美國)；生物安全柜(Thermo Fisher Scientific，美國)。

1.3 實時動態顯微技術檢測結腸小袋纖毛蟲 在生物安全柜內，用生理鹽水將待測糞便、腸內容物做適當處理，吸取混懸液滴片，采用實時動態顯微技術檢測樣本中寄生蟲病原體。根據蟲體的形態和大小來進行蟲種的鑒定。

1.4 引物設計和DNA提取 本研究針對結腸小袋纖毛蟲的轉錄間隔區(internal transcribed spacer ITS)，18S rRNA和SSU RNA(small subunit ribosomal RNA)基因區域，設計三對引物見表1。用QIAamp DNA Mini Kit提取結腸小袋纖毛蟲滋養體和包囊DNA。用QIAamp DNA Stool Mini Kit提取糞便和腸內容物樣本DNA。

表1結腸小袋纖毛蟲PCR引物序列

1.5 PCR和測序鑒定結腸小袋纖毛蟲 經過長時間的研究摸索建立并優化PCR檢測體系和反應條件，進行敏感度和特異度試驗并應用于實驗動物實際樣本中結腸小袋纖毛蟲檢測。PCR反應體系如下：5.0 μl 10×Buffer (Mg2+Plus)，4.0 μl dNTP Mixture，各0.5 μl上下游引物，0.25 μl EX Taq，2.0 μl模板DNA，用無核酸酶水(nuclease-free water)補足至50 μl。循環參數：95℃1 min 1 cycle；95℃30 s，60℃30 s，72℃1 min，40 cycles；72℃10 min 1 cycle。PCR結束后，用瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物。凝膠成像分析系統攝錄試驗結果。陽性樣本測序鑒定。

2 結果

2.1 實時動態顯微技術檢測結腸小袋纖毛蟲結果 可見少量巨大的卵形或橢圓形纖毛蟲滋養體，不停地快速旋轉運動，無色透明或淺灰略帶綠色，大小為(30～200)μm ×(25～120)μm，腹面略扁平，背面隆起，表面凹凸不平，體表完全覆蓋著纖毛形成密集的縱向行，蟲體前端有胞口和胞咽，后端有胞肛，中后部有伸縮泡，細胞質中含有許多食物顆粒及大小不等的食物泡，有腎形大核和圓形小核(圖1-A)。在一些滋養體內發現有許多內在生物，內在生物形態不規則，長度可達5 μm，能夠從蟲體壁形成囊泡而釋放到外界(圖1-B)。包囊近圓形或卵圓形，淡黃或淡綠色，直徑為40～60 μm，外被兩層囊膜，囊壁稍厚，囊內結構同滋養體，唯食物泡少；新形成的包囊內可見蟲體仍能活動(圖1-C)。依據纖毛蟲滋養體和包囊的大小和形態特征，鑒定為結腸小袋纖毛蟲。應用實時動態顯微技術檢測實驗動物結腸小袋纖毛蟲，結果從14 964份實驗動物樣本分離鑒定獲得4份結腸小袋纖毛蟲活體陽性樣本，陽性檢出率為0.03%。

圖1 中國實驗動物中結腸小袋纖毛蟲滋養體和包囊鏡檢形態(A，B：滋養體；C：包囊)

2.2 PCR和測序鑒定結腸小袋纖毛蟲結果 將實時動態顯微技術檢出的結腸小袋纖毛蟲滋養體和包囊，提取DNA做PCR檢測，結果在單個滋養體和包囊DNA樣本中，均可檢出結腸小袋纖毛蟲基因ITS(300 bp)，18S rRNA(354 bp)和SSU RNA(255 bp)特異性目的片段。將測序鑒定的陽性樣本基因序列實時遞交NCBI，通過BLAST在線比對分析，結果發現本研究獲得的實驗動物中結腸小袋纖毛蟲ITS，18S rRNA和 SSU RNA基因序列與GenBank中已公布的不同國家不同物種來源的結腸小袋纖毛蟲ITS，18S rRNA和 SSU RNA核苷酸同源性達99%～100%(GenBank登錄號為JN985904.1，AF045030.1，GQ903678.1，AY898942.1，AF029763.1)。應用PCR和測序技術檢測14 964份實驗動物實際樣本中結腸小袋纖毛蟲，結果檢出4份陽性樣本，陽性檢出率為0.03%。這4份陽性樣本均來自于豚鼠(表2)。

表2中國實驗動物中結腸小袋纖毛蟲感染情況

注：a) 實時動態顯微技術(real-time dynamic microscopy technique)；b) PCR和測序技術(PCR and sequencing technique)。

3 討論

感染性腸胃炎(infectious gastroenteritis，IGE)是由大量的細菌、病毒和寄生蟲引起的。腸道寄生蟲感染發生在世界上被邊緣化、低收入和資源受限的地區，在非洲、亞洲和美洲的發展中地區有超過10億的感染者。地球上大約有15 000個原生動物物種。結腸小袋纖毛蟲是一種原生動物，它可以導致人類、豬和非人類靈長類動物的痢疾，是一種人獸共患病病原體。結腸小袋纖毛蟲是人體最大的寄生原蟲。該蟲1857年首先由Malmsten[15]在兩名痢疾病人的糞便中發現，定名為結腸草履蟲(Parameciumcoli)。接著，Leukart[16]在豬的結腸中也有發現。1862年Stein[17]認為前兩人所見為同一種，更名為結腸小袋纖毛蟲(Balantidiumcoli)。結腸小袋纖毛蟲生活史分滋養體和包囊兩個發育階段。包囊在宿主的結腸和直腸中開始形成，通常在形成的糞便中發現包囊。包囊是病原體的傳播階段。包囊壁厚不易受干燥和其他環境壓力的影響。包囊在免受陽光直射潮濕的環境中生存最好。被感染性包囊污染的空氣、水、食物、水果、蔬菜可造成感染傳播。結腸小袋纖毛蟲包囊被宿主吞食后，在胃腸道中受消化液的作用，包囊內的蟲體脫囊而轉化為滋養體，并下行至結腸內定居。滋養體以淀粉、細菌、腸壁細胞等為食，主要以橫二分裂法進行繁殖。結腸小袋纖毛蟲感染在人類中并不常見。這種有機體雖然具有致病性，但毒性較低。以下三種臨床表現為：①輕度感染：導致間歇性腹瀉與便秘；②急性感染：滋養體攻擊腸道上皮，造成潰瘍和引起血痢類似于阿米巴痢疾，可能會有頭痛、發燒、惡心、嘔吐、腹痛和腸道絞痛。在少數病例中，可能發生腸穿孔性潰瘍，導致嚴重脫水、大出血休克甚至死亡；③慢性感染：間歇性腹瀉與便秘交替發生，糞便中含有大量的黏液，但很少有血液。免疫抑制、長期有其他慢性疾病(如糖尿病、慢性腎病)、營養不良或腸道正常機能發生改變時，結腸小袋纖毛蟲則易于侵入組織并發病。感染者腸道內的菌叢組成對該蟲的寄生或致病也具有一定影響，Ros-tkawska觀察發現變形桿菌、大腸埃希菌、沙門菌等對該蟲的發育產生有害作用；而肺炎克雷伯桿菌、金黃色葡萄球菌及腸桿菌等則有促進作用。結腸小袋纖毛蟲滋養體可分泌透明質酸酶及借助纖毛運動能侵及人體的多種臟器，如肝臟、肺、泌尿生殖道、闌尾等器官，引起肝膿腫、壞死性肺感染、子宮陰道炎癥、尿路感染、膀胱炎、腹膜炎，侵犯腸黏膜甚至黏膜下層，引起潰瘍。主要病變部位是盲腸和直腸，可延及全部結腸黏膜，偶爾也可侵及回腸末端。嚴重病例可出現大面積結腸黏膜的破壞和脫落[18～32]。

LI等[33]2013年5月檢出中國廣西壯族自治區籠養的120只恒河猴(macaca mulatta)糞便結腸小袋纖毛蟲陽性率為64.2%(77/120)，據推測，在這個非人類靈長類動物中心，有下列因素導致了恒河猴的結腸小袋纖毛蟲感染：①未受感染的猴子從同一籠子里的陽性猴子糞便中攝取了包囊；②水和/或食物被貓或鼠的糞便所污染；③人類和猴子之間的交叉感染。Hinde[34]收集了加勒比海靈長類動物研究中心46只圈養的恒河猴乳汁，研究發現：沒有感染結腸小袋纖毛蟲的母猴體內脂肪含量明顯高于有結腸小袋纖毛蟲感染的母猴體內脂肪含量，結果表明母猴結腸小袋纖毛蟲感染和乳汁脂肪之間的聯系顯著。Tatfeng[35]對234只被困在不同地點(廁所、客廳、廚房和臥室)的蟑螂進行細菌、真菌和寄生蟲分離，結果分離獲得了結腸小袋纖毛蟲、蛔蟲、鞭蟲、沙門菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、念珠菌、曲霉菌等病原體，因此，控制蟑螂將大大減少病原體在環境中的傳播。Rivera等[36]從墨西哥30名隨機挑選的女性齲齒患者的口、鼻和咽部檢出了結腸小袋纖毛蟲、溶組織內阿米巴等原蟲。這些無癥狀攜帶者可傳播此類原蟲。Drakulovski等[37]在喀麥隆43只猴免疫缺陷病毒(simian immunodeficiency virus，SIV)陽性和71只SIV陰性的野生黑猩猩糞便中檢出了結腸小袋纖毛蟲、溶組織內阿米巴、邁氏唇鞭毛蟲、縮小膜殼絳蟲等寄生蟲，這些高水平的寄生蟲感染可能會給在血液中存在大量SIV病毒的動物群帶來額外的負擔。Kouassi等[38]報道科特迪瓦白眉猴的結腸小袋纖毛蟲感染率為60.3%。Ryan等[39]報道加納狒狒的結腸小袋纖毛蟲感染率為62%。Yaghoobi等[40]報道伊朗野豬的結腸小袋纖毛蟲感染率為64%。目前，國內外尚未見有關實驗動物結腸小袋纖毛蟲監測分析的報道，用不同方法快速檢測鑒定該病原體的研究信息更少。因此，本研究調查分析了不同種實驗動物攜帶的結腸小袋纖毛蟲，識別了此寄生蟲，填補了這一研究空白。本次調查中，實驗動物的結腸小袋纖毛蟲感染率為0.03%。綜上所述，本研究對結腸小袋纖毛蟲進行了感染調查和分子診斷。應用實時動態顯微技術跟蹤監測寄生蟲，使用PCR結合基因測序技術從分子水平上對結腸小袋纖毛蟲進行確認，為快速準確鑒別診斷結腸小袋纖毛蟲感染提供新的思路。