綠膿桿菌致急性肺損傷小鼠的ATF3表達規律及意義

吳秀琳 陳光春 李明霞 郭亮 吳學玲

急性肺損傷(acute lung injury, ALI)/急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)是由各種肺內外致病因素導致炎癥失控，以急性呼吸困難，低氧血癥和非心源性肺水腫為特征的急性臨床綜合征，是膿毒血癥、爆發性流感、嚴重急性呼吸綜合征(severe acute respiratory syndrome, SARS)、重癥肺炎等疾病的主要死亡原因[1-4]。重度細菌感染造成的膿毒血癥是ALI最常見死亡原因之一，而綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa, PA)則是引發膿毒癥的常見致病菌之一。雖然通過有效抗生素及機械通氣等手段，臨床治療已取得了很大進展，但療效欠佳，其發病率及死亡率仍居高不下，病死率高達40%左右[5]。因此，進一步深入研究ALI/ARDS發病機制及防治則具有重大的臨床意義。

近年來研究證實，炎癥反應失控是ALI/ARDS本質，但其發病機制十分復雜，尚不完全明確。激活的巨噬細胞(activated macrophages, AMs)通常是早期肺部炎癥反應的導火索[6-7]，而激活的中性粒細胞(polymorphonuclearleukocyte, PMN)引起的炎癥失衡則被認為是ALI/ARDS的關鍵環節[8]，其在肺內過度募集、激活是啟動絕大多數ARDS的早期和重要事件，是造成過激炎癥反應的“元兇”[9]。而最新研究表明，巨噬細胞產生的活化轉錄因子3(activating transcription factor 3, ATF3)可抑制PMN在肺內的遷移[10]。很多研究均證實了ATF3對炎癥反應有“剎車”作用，是TLR4/NF-κB信號通路的重要的負性調控基因[10-14]。我們前期預實驗結果發現LPS腹腔注射后，ATF3 mRNA及蛋白表達 在2 h其mRNA水平出現明顯一過性升高。由此，基于文獻報道和前期實驗結果，我們推測ATF3可能通過負性調控炎癥損傷而參與調節ALI的發生發展。我們有理由相信上調ATF3的表達對急性肺損傷小鼠有保護作用，對于其在綠膿桿菌誘發的ALI肺部炎癥性損傷的保護作用仍需進一步證實。

本文旨在進一步明確ATF3在綠膿桿菌致急性肺損傷中的作用，繼續構建綠膿桿菌致急性肺損傷小鼠肺模，探討ATF3在綠膿桿菌致急性肺損傷中的表達規律及意義。

材料與方法

一、實驗材料

實驗細菌及實驗動物: ①綠膿桿菌: 系熒光標記綠膿桿菌，由復旦大學附屬中山醫院呼吸科宋元林教授贈予；②實驗動物: C57BL/6(17.8～26.25 g)小鼠，SPF級，購買于陸軍軍醫大實驗動物中心。

二、研究方法

1. ATF3在綠膿桿菌致ALI中的作用： 用經鼻滴注的方法，以熒光標記的濃度綠膿桿菌菌液(1.5×108PFU/ml，50 μl)建立小鼠綠膿桿菌誘導急性肺損傷小鼠模型，同時用生理鹽水作為陰性對照。采用組織切片和HE染色觀察肺組織病理變化；通過肺泡灌洗液(BALF)中的蛋白含量、肺組織干濕比測定肺微血管通透性和肺水腫程度變化；qRT-PCR檢測ATF3在野生型急性肺損傷小鼠肺組織中的表達規律。

2. 實驗設計和急性肺損傷小鼠模型的建立

(1)觀察ATF3在WT小鼠中綠膿桿菌誘導的ALI中的表達規律： 按照隨機數字表法隨機分組。首先將小鼠隨機分為2組，分別為：野生型小鼠對照組(WC組，即給予野生型小鼠生理鹽水)、野生型小鼠急性肺損傷組(WA組，即給予野生型小鼠經鼻滴入綠膿桿菌)。PA給予后0、3、6、12 h及24 h(每個時相點5只小鼠) 處理小鼠。

配制綠膿桿菌菌液： 將原始菌種從-80 ℃冰箱取出解凍后接種于哥倫比亞血平板，普通三區劃線后放置于37 ℃孵箱中24 h后長出大量菌落。用接種環取適量1～2個菌落至于無菌生理鹽水中，用DL-ZD1濁度計調至0.5個麥氏單位，相當于1.5×108cfu/ml(方法來源：引自衛生部規范教材《微生物學和微生物檢驗》第二版)。

將小鼠置于秤盤中稱重。

麻醉小鼠： 取一朵醫用棉球沾少許乙醚，并置于密閉的燒瓶內，然后將小鼠放入燒瓶內約20 s左右，見小鼠被麻醉后即取出小鼠，進行后續滴鼻操作。在用乙醚麻醉的過程中需掌握好麻醉時間，若麻醉時間過短則在后續操作過程中小鼠較活躍不易滴鼻操作，若麻醉時間過長則小鼠容易死亡。

綠膿桿菌/生理鹽水滴鼻： 用左手抓住被乙醚麻醉后的小鼠背頸部，頭部垂直向上，右手用10 μl移液器將綠膿桿菌菌液(以1.5×108cfu/ml的濃度)或生理鹽水共50 μl滴鼻以吸入至肺內，滴注過程中可見小鼠鼻孔處有氣泡產生，但嘴內無液體流出，表明綠膿桿菌經過呼吸道到達小鼠肺內。為利于吸入液體肺內分布，滴完后小鼠垂直放置約5 min，并用白熾燈加熱保暖。

麻醉小鼠： 按綠膿桿菌作用時間設置處理時間點，左手抓住背頸部皮膚，固定小鼠頭部，小指夾住尾巴，以45 ℃方向進針按戊巴比妥250 mg/kg劑量進行腹腔注射以麻醉小鼠。

肺泡灌洗： 待麻醉成功后，將小鼠固定于處理板上，解剖頸部，暴露氣管，在氣管上端剪一小口，置入自制氣管導管，用1 ml生理鹽水反復灌洗 3次，留取灌洗液約0.7～0.8 ml左右于EP管中，做好標記，置于-80 ℃冰箱備用。

收集標本： 固定小鼠于處理板上，打開胸腔，暴露肺臟組織，小心取下肺臟組織，右上肺用于提取蛋白，左肺用于提取RNA。

(2)檢測肺泡灌洗液中總蛋白含量: 用微量白蛋白測定試劑盒(鄰苯三酚紅比色法)測定肺泡灌洗液中總蛋白含量。

(3)肺組織干濕比: ①將移除的左肺立即用電子天平稱重為濕重；②烘烤箱內60 ℃下放置72 h至重量不在變化稱重為干重。

(4)小鼠肺組織病理檢測: 小鼠處理及實驗分組同前。

肺組織石蠟包埋及切片：①酒精脫水：將肺組織從4%PFA中取出進行梯度酒精脫水：75%乙醇、80%乙醇、90%乙醇分別脫水30 min，100%乙醇脫水兩次，每次30 min;②脫水透明：將肺組織置于透明劑二甲苯中進行透明兩次，每次30 min，以脫出組織中酒精;③浸蠟與包埋：將已透明的肺組織置于已溶化的石蠟中，隨之放入60 ℃烤箱中。待肺組織完全浸于石蠟后，用石蠟包埋機進行包埋。放置于4 ℃冰箱過夜，待冷卻凝固成塊;④切片：將包埋好的蠟塊固定于切片機上，用切片機切成薄片，切片厚度約為5 μm。

HE染色： ①將切下的薄片貼到載玻片上，置于45 ℃恒溫箱中烘干；②脫蠟：染色前使用二甲苯脫蠟2次，每次10 min；③由高到低濃度酒精梯度水化：分別于100%酒精，100%酒精，95%酒精，95%酒精水化各10 min，最后用ddH2O沖洗；④蘇木素水溶液中染色3 min，用ddH2O沖洗3 min；⑤用0.5%鹽酸酒精分色20 s，ddH2O沖洗1 min；⑥用0.5%伊紅染色3 min，ddH2O沖洗2 min；⑦60 ℃恒溫箱中將切片烘干，過夜; ⑧經純酒精脫水、二甲苯透明后的切片，滴上中性樹膠，蓋上蓋玻片封片，顯微鏡觀察切片。

肺損傷評分按照以下三項標準進行: ①肺泡和間質水腫；②肺泡出血；③中性粒細胞浸潤或聚集。每項標準又分四個等級：0=正常，1=輕度變化，2=中度變化，3=重度變化。最終的肺損傷得分為：三項標準評分的總和(總分為9)。

三、統計學方法

結 果

一、鏡下熒光標記的綠膿桿菌

鏡下熒光標記的綠膿桿菌，見圖1。

二、肺泡灌洗液總蛋白含量結果

1. WT小鼠吸入綠膿桿菌后肺泡灌洗液總蛋白含量： 為了證實ALI造模是否成功，我們用微量總蛋白試劑盒(鄰苯三酚紅比色法)測定肺泡灌洗液中總蛋白含量。用WT小鼠吸入綠膿桿菌后3 h肺泡灌洗液中總蛋白開始升高，于6 h出現高峰，與空白組存在顯著差異(P<0.05)，提示肺微血管通透性增加，見圖2。

2. ATF3對綠膿桿菌致急性肺損傷小鼠肺泡灌洗液總蛋白含量的影響： 本實驗提示WT小鼠(WA組)吸入綠膿桿菌后肺泡灌洗液中總蛋白明顯增加，較空白組、WC組重，說明WT小鼠吸入綠膿桿菌后肺微血管通透性增加，肺水腫程度加重。WA組較對照組及其他各組的結果存在顯著差異(P<0.05)，見圖3。

圖1 熒光標記的綠膿桿菌(100×)；圖2 WT小鼠吸入綠膿桿菌肺泡灌洗液總蛋白含量的時間梯度(a,b,c,P<0.05)；圖3 WT小鼠肺泡灌洗液總蛋白含量對比(a,b,c,P<0.05)

3. 肺組織干濕比結果: 為了進一步明確ATF3對綠膿桿菌誘導的ALI中肺水腫程度的影響，我們對肺組織干濕比進行了檢測，結果顯示，空白組的濕干比為11.76±0.404， WC組為11.615±0.414，WA組為13.25±0.216。本實驗提示吸入綠膿桿菌的的WA組肺組織干濕比增加，較空白組、WC組均重，說明WT小鼠吸入綠膿桿菌后肺水腫程度加重。WA組較對照組及其他各組的結果有顯著差異(P<0.05)。肺組織干濕結果與肺泡灌洗液中蛋白濃度結果相一致。

4. HE染色: 肺組織病理切片HE染色結果顯示，在WT小鼠吸入生理鹽水組(WC組)的肺泡間隔無明顯增厚，肺泡腔無明顯滲出，無明顯炎性細胞浸潤，與正常小鼠肺組織病理切片相比無明顯差異，圖4A。在吸入綠膿桿菌后6 h后，WT小鼠吸入綠膿桿菌組(WA組)肺泡結構破壞、肺泡間隔增厚、中性粒細胞浸潤、肺泡出血以及肺間質水腫，呈現為典型的急性肺損傷病理變化。按照實驗方法部分的標準進行肺組織損傷病理評分，結果顯示WA組的得分高于WC組，見圖4B。

圖4 小鼠肺病理學檢查(HE×100)；注：A：為WT小鼠滴入生理鹽水(WC組)；B：為WT小鼠滴入綠膿桿菌(WA組)

5. WT小鼠吸入綠膿桿菌后肺組織ATF3 相對表達時間梯度： 為明確ATF3在WT小鼠急性肺損傷肺組織中的表達規律，用qRT-PCR檢測WT小鼠吸入綠膿桿菌后肺組織ATF3 mRNA表達，于0、3 h、6 h、12 h及24 h時相點分別為1.006±0.136，9.954±0.624，4.578±1.463，2.342±0.122，3.249±0.680，結果顯示ATF3 mRNA于3 h達高峰，較0，6 h、12 h、24 h存在顯著差異(P<0.05)，見圖5。

討 論

ALI/ARDS是由炎癥失控而引起頑固性低氧血癥和嚴重呼吸困難為突出表現的臨床危急重癥[1]。綠膿桿菌是引發膿毒血癥常見致病菌之一，亦是引發ALI的常見病因。多年研究表明ALI/ARDS本質是炎癥反應失控，最終導致炎癥級聯反應而促發ALI/ARDS，但其發病機制十分復雜，至今尚不完全明確。故需深入探索ALI機制并針對炎癥信號通路以尋找一個新的基因治療靶點。

圖5 WT小鼠吸入綠膿桿菌肺組織中ATF3mRNA相對表達規律(a，b，c，d，P<0.05)

ATF3是新近發現的TLR4信號通路中的一個具有負性調控作用的炎癥調控因子。ATF3屬ATF/CRB(the activating transcription factor, ATF/cyclic AMP response element-binding, CREB)家族成員，它屬于應激早期快反應基因，在正常情況下于細胞內低水平穩定表達，但在各種應激信號(如炎癥、氧化應激、缺血缺氧等)刺激后其表達水平能迅速顯著提高。文獻報道，ATF3廣泛參與多種細胞活動的調控，許多疾病的發生發展均存在ATF3表達上調的適應性反應[13-19]。關于ATF3在綠膿桿菌誘導的ALI作用及機制的研究中，鮮有報道。

既往文獻報道，在膿毒血癥免疫抑制階段，ROS可誘導ATF3表達增加，從而抑制IL-6等細胞因子生成，導致繼發感染的敏感性增加[20]。在小鼠巨噬細胞中，ATF3能與巨噬細胞炎癥蛋白-1β(CCL4)啟動子ATF/CRE位點結合抑制巨噬細胞CCL4的表達和分泌，控制過度的炎癥反應[21]。ATF3對呼吸機相關性肺損傷(ventilator induced lung injury, VILI)亦有保護作用，ATF3通過降低機械通氣產生的環切力(CS)誘導的炎癥反應對肺損傷有保護作用，能抗衡環切力和高通氣帶來的炎癥[22]。上述結果均提示ATF3可降低炎癥反應，證實了ATF3對炎癥反應有“剎車” 作用，是TLR4信號通路中重要的負性調控基因。由此，我們有理由相信上調ATF3的表達對急性肺損傷小鼠具有保護作用。

為了評價ATF3的表達對綠膿桿菌致ALI小鼠的影響，我們先比較了WT小鼠吸入綠膿桿菌(WA組)、生理鹽水(WC組)后與對照組的肺泡灌洗液中總蛋白、肺組織干濕比和肺組織病理改變。實驗結果顯示，吸入綠膿桿菌的WT小鼠(WA組)肺泡灌洗液中，于6 h時相點肺泡灌洗液總蛋白出現高峰，肺泡灌洗液總蛋白含量較WC組、對照組明顯增加，肺組織干濕比明顯加重，肺組織炎癥病理改變明顯(大量中性粒細胞浸潤、肺泡結構破壞、肺泡出血及肺間質水腫)。上述研究結果說明WT小鼠吸入綠膿桿菌后肺微血管通透性增加，肺水腫程度加重，均提示經鼻滴入綠膿桿菌致急性肺損傷模型構建成功。PA菌液感染滴度為：1.5×108CFU/ml(相當于0.5個麥氏單位)，符合實驗要求。上述研究結果與文獻報道相一致[23-24]。

本研究以往Western blot試驗揭示[25]，WT小鼠吸入生理鹽水及綠膿桿菌均能誘導ATF3蛋白表達明顯增加，其中生理鹽水組在3 h時相點達最高峰，綠膿桿菌組在3 h、24 h時相點達最高峰，其中24 h較3 h峰值還高，均較空白組存在顯著差異。為再次印證ATF3的表達規律，本實驗結果顯示，吸入綠膿桿菌后可誘導ATF3 mRNA表達增加，在3 h時相點達最高峰，24 h時相點基本回到正常水平，結果與前期預實驗及文獻報道相一致[26-27]，與Western blot試驗[25]結果基本一致。再次證實了ATF3在應激信號出現后其mRNA水平能迅速提高這一現象，即存在ATF3表達上調的適應性反應[13-19]。本研究既往實驗已證實[28]，吸入綠膿桿菌的ATF3敲基因小鼠巨噬細胞釋放多種炎癥因子如IL-1β、IL-6、TNF-α的量出現明顯增加，于3 h達高峰，且明顯高于WT小鼠及對照組的表達，這一結果與文獻報道的LPS所致肺部炎癥反應時相點相一致[23-24,27,29-30]。本實驗中ATF3mRNA表達高峰在WT小鼠吸入綠膿桿菌后的3 h，與ATF3敲基因小鼠炎癥因子釋放高峰時相點相一致，并隨之逐漸下降，且各種炎癥因子表達高峰在吸入綠膿桿菌后的敲基因小鼠中表達明顯高于WT小鼠，提示ATF3在綠膿桿菌誘導的ALI小鼠中能夠抑制炎癥因子的表達，是一個具有負性調控的適應性基因。為研究ATF3調控ALI的機制，我們既往采用了Western blot方法檢測了NF-κB在小鼠肺組織的活性表達，實驗結果已證實了TLR4/NF-κB信號通路可能是ATF3負性調控ALI的信號通路之一[25]，與文獻報道一致[23-24,27,29-30]。

綜上所述，本實驗通過分析綠膿桿菌致急性肺損傷中ATF3的表達規律，提示上調ATF3能負性調控綠膿桿菌誘導的ALI的肺組織炎癥損傷，即ATF3對過激炎癥反應有負性調控作用，再次證實了ATF3作為負性調控基因對綠膿桿菌致ALI小鼠可能有一定保護作用。故上調ATF3的表達可能為治療ALI提供了新的治療靶點。