基于遺傳算法的卷煙主流煙氣粒相物pH值影響因素研究

賴燕華，陳森林，汪軍霞，吳君章，施文莊

廣東中煙工業有限責任公司技術中心，廣州荔灣區東沙環翠南路88號，510385

煙氣pH值是卷煙整體質量反映的綜合指標之一，反映了其中煙氣化學成分的酸堿平衡關系和煙氣煙堿的存在形態[1].煙草化學家們很早以前就注意到卷煙勁頭與卷煙主流煙氣中的煙堿含量有關[2]，煙堿在煙草及卷煙主流煙氣中大部分以結合態的質子化形式存在，小部分以非質子化的游離煙堿形式存在，卷煙勁頭與非質子化的游離煙堿形式有著更為密切的關系：游離煙堿含量越高卷煙勁頭就越大。由于煙堿的存在狀態與環境pH有關，因此可以通過測定煙氣中pH值來反映煙氣中游離煙堿占比，從而間接反映出卷煙勁頭的強弱[3]。

了解清楚哪些化學成分對煙氣pH有重要影響并建立相應的影響關系式，根據建立的關系式便可預測卷煙煙氣pH值，從而達到評估卷煙勁頭的目的?？梢?，建立卷煙煙氣pH值的影響因素定量關系模型至關重要。國內煙草企業和相關科研機構近年來進行了一些相關研究。邱寶平等[4]等對主流煙氣粒相物pH值與煙絲有機酸進行了關聯分析，評價了11種有機酸對煙氣pH值的影響程度；顧永波等[5]考察了煙氣pH值測定結果與感官評分的相關性；劉百戰等人[6]對不同的單料煙和不同類型的卷煙的煙氣pH值進行了測定，并將各種糖類、有機酸、生物堿、酚類等化學成分加入對照卷煙，考察了這些化學成分對煙氣pH值的影響規律。上述研究為卷煙煙氣pH值的調節提供了有益的參考，但上述研究均未建立煙氣pH值和影響因素之間比較準確的關系形式，對于實際生產的指導存在局限性。

本文擬對卷煙煙絲中的主要化學成分，包括糖、生物堿、氨基酸，有機酸和部分無機酸進行檢測，在較全面的數據基礎上，建立影響卷煙煙氣pH值的定量關系模型。而模型的實用性要求確定影響煙氣pH值的主要化學因素，如涉及指標太多，一方面檢測成本高，另一方面難以實現精準評估。對此，本研究應用遺傳算法（Genetic Algorithm, GA）[7,8]對煙絲化學成分進行特征優化，它借鑒生物界的自然選擇和遺傳機制，利用選擇、交叉和變異等操作，以給定的優化標準對變量進行篩選, 最終選擇影響煙氣pH值的主要化學因素，結合偏最小二乘法（Partial least squares, PLS）建立定量關系模型?；诰頍煒颖緮祿玫降慕Y論是否具有普遍性，即模型對樣本外的卷煙是否成立，對實際卷煙產品開發和生產是否具有實用意義，本研究采用留一法交叉驗證（Leave one out cross validation, LOOCV）證實了模型的有效性。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

國內烤煙型卷煙共30種，包括一類卷煙10種、二類卷煙10種、三類卷煙10種。

1.2 主流煙氣總粒相物pH值的測定

試劑：異丙醇（分析純），二次水。

儀器：RM200A吸煙機（德國Borgwaldt公司），836自動電位滴定儀（瑞士萬通公司，結果精確至0.01）。

實驗方法：按照《GB/T 19609-2004 卷煙用常規分析用吸煙機測定總粒相物和焦油》要求，將測試卷煙置于溫度（22±2）℃，濕度60%±5%環境下平衡48 h，用轉盤吸煙機吸煙，將20支煙捕集到一個濾片上。將濾片取出后放置于饅頭瓶中，加入現配的1:1（v:v）異丙醇水溶液80 mL，振蕩30 min，立即取上層清液用已校準的電位滴定儀測定溶液pH值，平行兩次。結果精確至小數點后兩位，兩次平行測試結果之差不大于0.05。

1.3 外加化學成分對總粒相物pH值的影響

外加化學成分包含：丁酸、異戊酸、乙酰丙酸、蘋果酸、葡萄糖、異亮氨酸、精氨酸和煙堿。

稱取0.1 g固體或液體試劑, 將丁酸、異戊酸、乙酰丙酸、蘋果酸和煙堿分別溶于1 mL乙醇，將葡萄糖、異亮氨酸和精氨酸分別溶于1 mL水。用微量注射器吸取100 μL各溶液, 分別均勻地注入1號樣品卷煙煙支中，平衡72小時后，按照1.2所述方法主流煙氣總粒相物pH值，每種外加成分平行測定三次。

將100 μL乙醇或水注入注入1號樣品卷煙煙支，作為對照樣品測定其主流煙氣pH值。

1.4 煙絲化學成分檢測

1.4.1 水溶性糖

果糖、葡萄糖和蔗糖三種水溶性糖采用高效液相色譜法[9]測定。

1.4.2 有機酸

有機酸采用甲酯化GC-MS方法[10]進行測定，共檢測了15種有機酸，分別是乙酸、丁酸、異戊酸、乳酸、草酸、丙二酸、乙酰丙酸、丁二酸、苯乙酸、蘋果酸、棕櫚酸、檸檬酸、硬脂酸、油酸和亞油酸。

1.4.3 磷酸

采用硅烷化GC-MS方法測定卷煙煙絲的磷酸含量。GC/MS條件和樣品前處理參考文獻[11]的方法：準確稱取10 mg 煙末，置于2 mL色譜瓶中，加入1 mL提取溶液，于70 ℃烘箱中進行衍生化反應30 min，取上層清液，用0.45 μm有機濾膜過濾，轉移至干凈色譜瓶中，得到GC/MS分析樣品溶液。以乙酸苯乙酯-D3為內標，采用內標標準曲線法對磷酸進行定量。

1.4.4 生物堿

檢測指標：煙堿、降煙堿、麥斯明、假木賊堿、二烯煙堿、新煙草堿、2,3-聯吡啶、可替寧、N-甲?；禑焿A。

儀器與試劑: 三氯甲烷（色譜純），氫氧化鈉（分析純），氨水（分析純）、無水硫酸鈉（分析純，550 ℃干燥至少5 h），三乙胺（色譜純），2-甲基喹啉，2,4’- 二聯吡啶，煙堿，降煙堿，麥斯明，假木賊堿，新煙草堿、二烯煙堿、2,3’聯吡啶、可替寧和N-甲?；禑焿A等標準物質，純度至少98%；感量0.1毫克分析天平；超聲波清洗機；Agilent 7890A/5975C型氣相色譜質譜聯用儀；彈性毛細管柱DB-35MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）。

樣品前處理：稱取約0.3000 g煙草制品粉末于50 mL錐形瓶內，精確至0.0001 g，加入5.0 mL 5%（質量分數）的氫氧化鈉溶液于錐形瓶中，輕搖錐形瓶，濕潤試樣，靜置15 min，然后加入20 mL 0.01%三乙胺的三氯甲烷溶液（含內標2-甲基喹啉和2，4′- 二聯吡啶），加蓋密封后置于超聲波清洗機內，超聲提取15 min。超聲后于5000 r/min離心5 min后取2 mL下層溶液經無水硫酸鈉和有機相濾膜后轉移到色譜分析瓶中進行GC/MS分析。

1.4.5 游離氨基酸

游離氨基酸檢測指標：天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、β-丙氨酸、組氨酸、精氨酸。

試劑：濃鹽酸（濃度37%，德國Merck KGaA公司）；無水乙醇（分析純，廣州化學試劑廠）；苯酚（分析純，廣州化學試劑廠）；硼酸（99.5%，美國Sigma-Aldrich公司）；茚三酮（北京捷盛依科科技發展有限公司）；pH5.51鉀鈉緩沖溶液（北京捷盛依科科技發展有限公司）；檸檬酸（純度99.5%，美國Sigma-Aldrich公司）；氨基酸標準品（美國Sigma-Aldrich公司）；一水合氫氧化鋰（純度99%，美國Sigma-Aldrich公司）；氧化鋰（純度99%，美國Sigma-Aldrich公司）。

儀器系統及條件：SYKAM-S433D氨基酸分析儀；流動相流速：0.45 mL/min；茚三酮流速：0.25 mL/min；進樣體積：50 μL；檢測器：雙通道紫外檢測；反應管溫度：130 ℃。采用梯度洗脫程序和溫度梯度程序進行分析（略）。

樣品處理：稱取約0.5 g（精確至0.0001 g）試樣于50 mL具塞三角瓶中，準確加入20 mL鹽酸溶液，震蕩30 min；取部分到10 mL聚丙稀離心管中，15000轉20 min離心；取上清液2 mL到10 mL玻璃離心管中并加入8 mL無水乙醇，搖勻，靜置10 min后，以5000轉/min速度離心30 min；取7.5 mL清液于試管中，氮氣吹干，加入1.5 mL 0.01 mol/mL鹽酸溶液復溶樣品并移至色譜瓶中，上機測定。

1.5 遺傳算法（GA）操作步驟

GA是一種借鑒自然界中生物的進化規律演化而得來的一種隨機搜索方法，它由美國Michigan大學的J.Holland 教授于1975 年率先提出。本文GA的編碼方式、適應函數、選擇、雜交以及變異操作描述如下：

1）編碼方式：將檢測的每一種煙絲化學成分作為染色體的一個基因，采用[01]二進制編碼方式對基因編碼，若基因編碼為“1”，則該化學指標參加PLS建模，若編碼為“0”,則該化學指標不參與建模。

2）種群初始化：設定種群數目為50，采用隨機初始化的方式，隨機產生50條二進制編碼的染色體。

3）適應函數：首先對染色體進行解碼，將染色體中所有編碼為“1”的基因對應的化學指標代入PLS進行建模，然后計算模型交叉驗證預測結果的均方根誤差（RMSECV）,將RMSE設為GA的適應函數。

4）選擇、雜交和變異操作：在GA中，選擇就是從群體中選擇出具有較高的適應值的個體，使它們有機會作為父代通過雜交等操作把優良的基因遺傳給下一代。選擇實現了達爾文的適者生存原則，并且有多種選擇方式，例如：適應值比例方法、隨機遍歷抽樣法以及賭輪盤選擇法等。在本文中我們采用精華策略用于選擇操作。由于精華策略保證了當前代中具有最高適應值的個體始終出現在下一代，因此當前群體中適應函數的最大值總是隨著進化代數的增加而單調遞增或保持不變[12]。

5）最優變量組合：設定終止代數為200，以目標函數RMSECV最小時的基因編碼解碼后得到的變量組合為最優變量組合。

GA-PLS 程序在Matlab R2017a環境下編寫。

2 結果與討論

2.1 煙氣pH值及煙絲化學成分分布情況

30 種卷煙樣品的煙絲水溶性糖、酸、氨基酸成分含量分布圖見附件。煙氣pH值以及大部分煙絲化學成分的分布比較均勻，各樣品煙絲化學成分主要集中在平均值附近，除檸檬酸、異戊酸和麥思明等少數成分外，大部分化學成分在低端和高端分布的樣品數量基本一致。煙氣pH值主要分布在6.00～6.33之間；水溶性糖中，煙絲果糖成分含量最高，主要分布在5.36%～8.95%之間，葡萄糖含量分布在3.17%～6.83%之間，蔗糖含量分布在0.33%～1.98%之間；本文檢測的15種有機酸化學成分含量差異較大，蘋果酸含量最高，分布在55.06～70.62 mg/g之間，丁酸和苯乙酸含量最低，分別分布于35.20～39.76 μg/g之間和21.70～45.72 μg/g之間；磷酸含量分布于3.10～4.85 mg/g之間；生物堿含量差異很大，其中煙堿含量最高，分布于19.50～22.40 mg/g之間，二烯煙堿含量最低，分布于1.80～2.60 μg/g之間；煙絲游離氨基酸含量也存在較大差異，其中脯氨酸含量最高，分布于3.49～5.95 mg/g之間，β-丙氨酸含量最低，分布于3.93～10.71 μg/g 之間。

2.2 煙氣pH值與煙絲化學成分相關性

對煙氣pH值和煙絲化學成分進行相關性分析，結果列于表1，與煙氣pH值顯著相關（p＜0.05）的煙絲化學成分以“*”標記。從表中可以看出，異戊酸、棕櫚酸、硬脂酸、油酸和亞油酸與pH值呈顯著負相關；天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、異亮氨酸、酪氨酸、β-丙氨酸和可替寧與pH值呈顯著正相關。然而，通過對煙絲的化學成分之間的相關分析發現，煙絲化學成分之間也存在明顯的相關關系（具體細節省略）。因此，很難根據簡單相關分析結果來判斷煙絲化學成分對煙氣pH值的影響。

表1 煙氣pH值和煙絲化學成分相關分析結果Tab.1 Results of correlation analysis between pH value of TPM and chemical composition in cut tobacco

2.3 影響煙氣pH值的主要化學成分的確定

本文所采用數據的樣本個數為30，自變量個數42，屬于小樣本情景。此外，煙絲化學因素之間有明顯的相關關系，如果直接利用這些自變量對煙氣pH值進行簡單線性回歸，就會導致嚴重的多元共線性和過擬合問題，會降低分析的準確性，減小模型的解釋能力。而且，考慮到模型在卷煙研發及生產時，如果模型中煙絲化學成分變量過多，則檢測和研發成本將過于昂貴，模型將失去應用價值，因此，變量選擇對于模型的適用性至關重要。

綜合以上因素，本文在建立煙氣pH值影響因素定量分析模型時，采用GA對煙絲化學成分進行變量優化選取，找到影響煙氣pH值最主要的化學成分指標，以在改進模型預測精度的同時更好地滿足企業生產研發的需求。定量模型采用PLS法。為了保證模型的可靠性，在研究過程中采用LOOCV對所建立模型的預測能力進行了考察。

2.3.1 數據預處理

為了得到可靠的計算結果，對煙絲化學成分檢測數據進行了數據預處理。由于42種化學成分的量綱和變化幅度不同，其絕對值相差很大。為此，在建立模型前，對煙絲化學成分檢測數據進行了min-max 標準化處理。

2.3.2 PLS模型主成分數的確定

在PLS建模過程中，主成分數的確定至關重要，關系到模型的穩定性和準確性。根據不同主成分數時PLS模型的LOOCV預測結果的殘差平方和（PRESS）確定主成分數。在GA-PLS運行過程中，每一代種群代表的變量進行PLS建模時，均對主成分數進行優化，選擇PRESS最小時對應的主成分數為最佳主成分數。

2.3.3 GA-PLS模型分析結果

在本文中，優化的目標為選擇對煙氣pH值具有重要性的煙絲化學成分，可能的答案為各種化學成分的一種組合。根據煙氣pH值建模結果，對42項化學成分進行篩選，以所建立模型RMSECV最小的模型為主要依據。GA遺傳代數設為1000，每一代中所有種群的RMSECV的最小值隨遺傳代數的變化情況如圖1所示。從圖中可以看出，隨著遺傳代數的增加，最優種群的適應函數值（即RMSECV）的最小值逐漸收斂，在遺傳代數從1到110的進化過程中，適應函數值急劇減小，在110到200代的進化過程中，適應函數值變化較平穩，并趨于穩定。

圖1 GA-PLS模型的RMSECV隨遺傳代數的變化趨勢Fig.1 Variation tendency of root-mean-square error of cross validation of GA-PLS with genetic generations

由于GA隨機產生初始化種群，所以每次運行GA-PLS程序產生的結果會略有差異。因此，在進行變量選擇時，運行了5次GA-PLS程序，產生5組變量組合，同樣以RMSECV為評價標準從中選擇最優變量組合。最終產生的最優特征子集包含了8個變量，它們分別是：丁酸、異戊酸、乙酰丙酸、蘋果酸、葡萄糖、異亮氨酸、精氨酸、煙堿?；谠撎卣髯蛹⒌腉A-PLS模型和以所有煙絲化學成分作為輸入變量的PLS模型對煙氣pH值的預測分析結果如圖2所示。用于建立GA-PLS模型和PLS模型的主成分數分別為4和6。從圖中可以看到，GA-PLS模型明顯優于PLS模型，使用GA進行特征篩選后，變量數由42降低為8，RMSECV由0.0404降為0.0261，預測值和實測值的決定系數由0.7522提高至0.9016，說明GA篩選出的8個化學指標對煙氣pH值有良好的解釋能力，表明丁酸、異戊酸、乙酰丙酸、蘋果酸、葡萄糖、異亮氨酸、精氨酸和煙堿對煙氣pH值影響最大。

圖2 (a)GA-PLS模型和(b)PLS模型對煙氣pH值的預測結果Fig.2 Quantitative prediction results of pH value of TPM by (a) GA-PLS model and (b) PLS model

2.3.4 影響因素貢獻度

丁酸(x1)、異戊酸(x2)、乙酰丙酸(x3)、蘋果酸(x4)、葡萄糖(x5)、異亮氨酸(x6)、精氨酸(x7)和煙堿(x8)進行PLS擬合得到煙氣pH值（Y）的回歸標準化方程：

根據回歸系數可以看出，丁酸(x1)、異戊酸(x2)、乙酰丙酸(x3)、蘋果酸(x4)、葡萄糖(x5)、精氨酸(x7)可以降低煙氣pH值, 這與有機酸、糖類可以顯著降低煙氣粒相物的結論是一致的[6]。異亮氨酸(x6) 和煙堿(x8)可以增加煙氣pH值，這與煙堿可以顯著增加卷煙勁頭是吻合的。

為考察各化學成分對煙氣粒相物pH值的貢獻度，計算了丁酸、異戊酸、乙酰丙酸、蘋果酸、葡萄糖、異亮氨酸、精氨酸和煙堿的變量投影重要性指標（Variable importance in projection, VIP）。VIP反應了每個自變量xj在解釋因變量Y時的作用重要性[13]，其計算公式如下：

式中VIPj表示第j個自變量xj的重要性因子，P表示自變量的個數，m為提取的有效主成分個數，Whj為軸Wh的第j個分量；Rd(Y;th)表示主成分th對因變量Y的解釋能力，Rd(Y;t1, t2,…tm)表示m個成分t1, t2,…tm對Y的累計解釋能力。

表2為VIP計算結果。從表中可以發現，8個化學成分指標的VIP都大于1，說明丁酸、異戊酸、乙酰丙酸、蘋果酸、葡萄糖、異亮氨酸、精氨酸和煙堿對煙氣粒相物pH 值的解釋有重要的作用，也進一步說明了遺傳算法的有效性。其中，可降低煙氣pH值的各指標（丁酸、異戊酸、乙酰丙酸、蘋果酸、葡萄糖、精氨酸）中，乙酰丙酸VIP值最高，其次為異戊酸和葡萄糖，說明煙絲乙酰丙酸、異戊酸和葡萄糖含量的提升對煙氣pH值的降低作用最明顯；根據回歸方程，煙堿和異亮氨酸對煙氣的pH值的影響為正向，而表2中的結果顯示，兩者VIP值均很高，說明煙絲煙堿和異亮氨酸的增加對煙氣pH值的提升作用很明顯。

表2 變量重要性投影結果Tab.2 Projection result of importance of variable

表3 外加化學成分對主流煙氣粒相物pH值的影響Tab.3 Effect of added chemicals on the pH value of TPM

為驗證模型中的各指標對主流煙氣pH值的影響，分別將丁酸、異戊酸、乙酰丙酸、蘋果酸、葡萄糖、異亮氨酸、精氨酸和煙堿配制成0.1 g/mL的水溶液或乙醇溶液，用微量注射器吸取100 μL加入卷煙中，以空白水溶液或乙醇溶液加入卷煙中作為對照，分別測定其主流煙氣pH值，考察這些化學成分加入后煙氣粒相物pH值的改變情況，結果列于表3。對每種化學成分進行三次試驗，表中添加化學成分后的煙氣pH值為三次實驗的平均值，相對標準偏差介于0.06%～0.25 %之間，表明實驗結果較穩定。從表3可以看出，加入丁酸、異戊酸、乙酰丙酸、蘋果酸、葡萄糖、精氨酸后，主流煙氣粒相物pH值均有不同程度的降低，其中蘋果酸降低幅度最大，乙酰丙酸和丁酸對粒相物pH 值的降低作用明顯；加入異亮氨酸和煙堿后，主流煙氣粒相物的pH值有不同程度的提高，其中煙堿對粒相物pH值的提升作用更為明顯。實驗結果和回歸模型分析結果基本一致，雖然各組分施加后對粒相物pH值的改變程度與回歸系數的大小不完全一致，但大致方向基本吻合，因此可認為，本文建立的煙氣pH值與煙絲化學成分之間的定量關系模型，較為客觀地反應了煙絲化學成分對主流煙氣粒相物pH值的影響。另外，值得注意的是，本實驗中標準品的實際外加量為10 mg，與卷煙中實際含量存在很大差別，根據實驗結果探索了各化學成分加入后對煙氣pH值改變的趨勢，但在實際應用中如何利用該趨勢調控煙氣總粒相物pH值還需要進一步深入研究。

3 結論

本文檢測了42種煙絲化學指標，采用遺傳算法結合偏最小二乘法，篩選出8個對煙氣總粒相物pH值影響最大的化學指標，建立了煙氣pH值與煙絲化學成分之間的定量關系模型。本文建立的方法可指導生產實踐中通過檢測較少的煙絲化學成分，較為客觀地預測卷煙的煙氣pH值，進而評估卷煙勁頭。