基于指紋圖譜評價葛根芩連湯中藥物的成分分析研究

李 紅 田 潔 李 妍 王 艷 張 穎

(河北省唐山市中醫醫院藥學部,唐山,063000)

葛根芩連湯是出自張仲景的代表作《傷寒論》中的表里雙解的代表方,該方全方共4味藥物,分別為葛根、黃連、黃芩、甘草;《傷寒論》中原文描述“太陽病,桂枝證,醫反下之,利述不止,脈促者,表未解也,喘而汗出者,葛根黃連黃芩湯主之”。說明患者表證未除,邪陷入里,腸熱下利,而葛根芩連湯治之以解表清里、升清止利[1]。葛根芩連湯現代應用主要為熱性傳染病、以腹瀉為主訴的疾病等[2-3],而在現代藥物分析中有關該方物質基礎和質量控制等方面的研究報道質量參差不齊,目前中藥分析多采用中藥指紋圖譜這一研究手段,對中藥(復方)成分進行質量評價體系分析;然目前的多數研究大多數以個別幾個成分入手進行研究[4],因此所獲得的指紋圖譜僅有色譜峰的圖譜信息,或特征性色譜峰與復方藥物成分的相關性信息研究有限[5]?；诖?本課題組從整體角度采用HPLC指紋圖譜的方法分析葛根芩連湯10種以上多種藥物成分的深入研究,為葛根芩連湯中含有的藥物成分等物質基礎、藥理相關性研究提供實驗基礎。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 購于安捷倫科技(中國)有限公司的HPLC(高效液相色譜儀,型號:Agilent-1100)和DAD(二極管陣列檢測器,型號:G1315DAD)。

1.2 試劑 購于上海展云化工有限公司色譜HPLC乙腈和色譜HPLC甲醇;中國食品藥品檢定研究院提供的超純水和葛根素對照品(110752-200410)、大豆苷對照品(111738-200501)、大豆苷元對照品(486-66-8)、黃芩苷對照品(110715-200514)、漢黃芩苷對照品(51059-44-0)、黃芩素對照品(111514-200403)、漢黃芩素對照品(111514-200403)、小檗堿對照品(110713 200208)、鹽酸巴馬汀對照品(0732 200005)、鹽酸藥根堿對照品(0733 200005)、甘草酸銨對照品(110731-200614)、甘草次酸對照品(110723-200612)、甘草苷對照品(111610-200604)、染料木素對照品(111704-200501)。

1.3 分析樣品 葛根芩連湯:葛根、黃連、黃芩、甘草。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 HPLC指紋圖譜試驗進樣量為20 μL,色譜柱選擇直徑5 μm的Ultimate AQ C18柱(青島君道生物技術有限公司),柱溫30 ℃,流動相A是0.02 mol/L醋酸銨+0.3%三乙胺+1%冰醋酸混合而成,最終PH值為4.3;流動相B是乙腈,流速統一為0.7 mL/min,具體洗脫程序見表1。檢測波長通過預實驗不斷調整,最終葛根素、大豆苷、大豆苷元、染料木素、甘草酸銨和甘草次酸的檢查波長為250 nm;黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素和甘草苷檢測波長為280 nm;余下對照品檢測波長為346 nm。本研究中HPLC方法考察和指紋圖譜等均采用此色譜條件。

表1 梯度洗脫表

2.2 對照品溶液的制備 精密稱量各個對照品,分別加入60%的甲醇制作對照品溶液,將1.029 g/L葛根素對照品、0.201 g/L大豆苷對照品、0.049 g/L大豆苷元對照品、0.384 g/L黃芩苷對照品、0.062 g/L漢黃芩苷對照品、0.106 g/L黃芩素對照品、0.036 g/L漢黃芩素對照品、0.059 g/L小檗堿對照品、0.043 g/L鹽酸巴馬汀對照品、0.060 g/L鹽酸藥根堿對照品、0.392 g/L甘草酸銨對照品、0.038 g/L甘草次酸對照品、0.303 g/L甘草苷對照品和0.0132染料木素對照品等不同質量濃度的單一對照品混合均勻,過濾得混合對照品溶液。

2.3供試品溶液的制備:葛根芩連湯的藥物飲片分析樣品為葛根30 g、黃芩20 g、炙甘草6 g、黃連6 g,均由河北伊康藥業有限公司提供。單一藥物的供試品溶液均分別以400 mL水浸泡20 min后煎煮30 min,以0.45 μm過濾膜過濾后獲得葛根、黃芩、黃連、甘草供試品溶液;葛根芩連湯的供試品溶液,同上法浸泡藥物,葛根先煎20 min后納入余下幾味藥物繼續煎30 min,以0.45 μm過濾膜過濾后獲得葛根芩連湯供試品溶液。

2.4 專屬性試驗 通過專屬性試驗檢測葛根芩連湯各味藥物的專屬性,相互間是否存在干擾因素,結果顯示在相對保留時間內各個峰之間不存在雜質峰,專屬性良好。

2.5 線性關系考察 精密量取混合對照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.6 mL,分別置2 mL量瓶中,加60%甲醇稀釋至刻度,搖勻后制得不同質量濃度的混合對照品溶液,采用HPLC色譜法,記錄峰面積;以對照品進樣量(μg)為橫坐標(X,峰面積積分值為縱坐標(Y),繪制標準曲線,結果顯示14個對照品線性關系均良好。

2.6 中間精密度試驗 精密稱取同一葛根芩連湯供試品溶液,連續進樣6次,結果顯示共有峰的平均相對峰面積RSD為0.38%,表面高效液相色譜儀的精密度良好。

2.7 供試品溶液穩定性試驗 將葛根芩連湯室溫放置0、2、4、12、24 h分別常規進樣測定HPLC色譜圖,結果顯示平均相對峰面積RSD為1.03%,表明葛根芩連湯供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.8 重復性試驗 以同一批藥材,根據2.2配制6份葛根芩連湯供試品溶液,常規進樣測定HPLC色譜圖,結果顯示平均相對峰面積RSD為1.14%,表明供試品溶液提取方法具有良好重復性,且高效液相色譜儀重復性良好。

2.9 回收率試驗 精密稱取6份已知含量的同一批葛根芩連湯樣品各約4.75 g,分別精密加入10 mL混合對照品甲醇溶液,采用加樣回收法測定,計算結果顯示平均回收率的范圍是96.45%～104.69%,RSD的范圍是為0.65%～2.11%,表明HPLC方法的準確度良好。見表2。

2.10 樣品測定結果

2.10.1 混合對照品溶液的指紋圖譜 本研究根據不同的檢測波長250 nm、280 nm和346 nm,將混合對照品指紋圖譜分為3張圖,便于后續分析,同時標注14個對照品成分的峰號。見圖1。

圖1 混合對照品溶液的指紋圖譜

注:1葛根素,2大豆苷,3甘草苷,4黃芩苷,5鹽酸藥根堿,6漢黃芩苷,7大豆苷元,8鹽酸巴馬汀,9小檗堿,10甘草酸胺,11黃芩素,12漢黃芩素,13染料木苷,14甘草次酸

表2 加樣回收試驗結果

2.10.2 單一藥物供試品溶液的指紋圖譜 在檢測波長為250 nm時,葛根指紋圖譜有11個特征峰,而甘草有2個特征峰;在檢測波長280時,黃芩有6個特征峰,而在檢測波長346 nm時,黃連有4個特征峰。見圖2。

圖2 葛根、黃芩、黃連、甘草單一藥物的指紋圖譜

2.10.3 葛根芩連湯藥物成分分析 在葛根芩連湯的指紋圖譜中顯示波長250 nm時有12個特征峰,其中1～11主要體現葛根的藥物成分特征,而12主要體現甘草的藥物成分特征;波長280 nm時有7個特征峰,主要體現甘草和黃芩的藥物成分特征;波長346 nm時有4個特征峰,主要體現黃連的藥物成分特征,在與混合對照品指紋圖譜比較分析后,由圖3及其注解中可見葛根芩連湯指紋圖譜各個峰號對應的藥物成分,我們發現葛根芩連湯未檢測出甘草次酸和染料木苷成分色譜峰。

圖3 葛根芩連湯不同檢測波長的指紋圖譜

注:3.葛根素,5大豆苷,11大豆苷元,12甘草酸胺,13甘草苷,15黃芩苷,17漢黃芩苷,18黃芩素,19漢黃芩素,20鹽酸藥根堿,22鹽酸巴馬汀,23小檗堿

3 討論

3.1 指紋圖譜的建立 中藥指紋圖譜研究目前多采用HPLC的研究手段,以作為一種多指標的質量控制模式,通過指紋圖譜結合多成分分析,相對全面體現復方中所含化學成分,這一中藥指紋圖譜研究已成為廣泛被國內外研究人員認可的中藥質量評價模式[6-7]。本研究在3個不同波長里(250、280、346 nm)考察了葛根芩連湯供試品溶液、葛根芩連湯單一藥物供試品溶液和14種混合對照品溶液,因為葛根芩連湯中的藥物成分較多較復雜,若只選擇一個波長來檢測,可能或漏掉很大一部分的藥物成分,而對結果造成一定的誤差,因此本研究選擇3個不同波長進行檢測,并為了方便不同波長間指紋圖譜的比較分析,在結果呈現時將指紋圖譜根據波長切成3張圖片。葛根芩連湯供試品溶液指紋圖譜經多點校正法標定了23個共有峰,通過比較混合對照品指紋圖譜、單味藥材指紋圖譜和葛根芩連湯供試品指紋圖譜出峰位置,23個共有峰得到歸屬,12個共有峰確定了化學成分,其中染料木苷和甘草次酸未檢測出來,可能與這2個藥物成分的含量比較低有關,需要后續進一步研究探討。本實驗結果也表明,葛根芩連湯提取方法穩定且藥物成分較多。

3.2 指標成分的選擇 中藥復方藥效的發揮與其中的化學成分密不可分,而其中具體的化學成分,以及各藥物成分間含量的高低、藥物成分的穩定性等都與藥效的強弱有至關重要的關系[8-11]。通過與多指標成分定量相結合,中藥指紋圖譜能夠相對全面且有效的控制中藥質量,這一研究通經被大量研究運用。大量文獻報道顯示[12-13],葛根中的葛根素、大豆苷、大豆苷元是被普遍認可的植物類雌激素,葛根素具有抗炎和改善血液流變等作用;大豆苷、大豆苷元具有鎮痛、松弛肌肉等作用緩解腹瀉引起的腹痛。黃芩中的黃芩苷和漢黃芩苷具有抗炎活性,黃芩素和漢黃芩素可增加血流,改善血液循環。黃連中的鹽酸藥根堿、小檗堿和鹽酸巴馬汀具有抗氧化、抗炎活性。甘草中的甘草苷、甘草酸銨具有抗炎、抗變態反應等作用。本研究所選取的14個成分,均與腹瀉為主的疾病的發病環節有著密切的關系,從有效成分角度將其作為質量控制的指標成分,對葛根芩連湯的內在質量作出了更為科學的評價。