水分脅迫對桃葉杜鵑菌根苗根系超微結構的影響

熊賢榮，歐陽嘉暉，龍海燕，熊 丹，歐 靜

(貴州大學林學院，貴州貴陽550025)

桃葉杜鵑(RhododendronannaeFranch.)是杜鵑花科杜鵑花屬常綠灌木，為高山常綠杜鵑代表種[1]，其花艷麗奪目，葉形美觀，樹冠圓滿，花期5—6月，是一種觀賞價值高、開發潛力大的園林樹種，但其喜涼爽濕潤氣候，且根系為淺根系，不能伸入土層深處，不耐干旱，嚴重制約其引種栽培及園林應用。菌根(Mycorrhiza)是一類土壤真菌與高等植物根系形成的共生體系，其在自然生態系統中廣泛存在[2]，能夠促進根系對水分的吸收，防止根系內水分的喪失，改善寄主植物的水分狀況，提高植物的抗旱性[3]。

干旱影響植物生產發育的主要非生物脅迫之一，其對植物生長的影響直接體現在植物葉片失水，細胞膜遭到破壞，嚴重時破壞細胞器結構，加速其衰老進程，最終導致植物死亡[4]。目前對于干旱脅迫下接種菌根對植物根系的研究主要集中在植物根系形態解剖結構方面，如王如巖等[3]發現接種內生菌根能促進楸樹根系形態發展，在正常水分和中度干旱條件下內生菌根真菌對楸樹生長有一定的促進作用。張亞敏等[5]通過對小馬鞍羊蹄甲幼苗接種AMF，發現AMF能顯著影響幼苗根系形態特征和結構特征,更利于植物適應干旱環境。在自然環境條件下，杜鵑屬植物根系能與一些土壤真菌形成典型特征的共生體，稱為杜鵑花類菌根或歐石南類菌根(Ericoidmycorrhizal，ERM)[6]，在杜鵑花類植物的生長發育中扮演著重要角色，它能促進植物生長，對植物克服惡劣環境、加強吸收養分起到很重要的作用[7-8]，能增強宿主植物的競爭力和抗逆性[9]，有研究證明ERM可以增強宿主抗旱性[10]。在超微結構方面,菌根的形成對寄主質膜及細胞骨架結構有一定的影響，而且菌根的形成會影響寄主質膜及細胞骨架結構從而影響細胞內的液泡、線粒體、細胞核等細胞器[11-12]。而關于干旱脅迫下菌根對植物細胞超微結構方面的研究還未見報道， 桃葉杜鵑的根系由大量細弱如發的須根組成，由1層表皮細胞、1～2層皮層細胞和中柱組成，本實驗材料為1年生桃葉杜鵑幼苗，進行干旱脅迫處理，通過觀察根系中柱細胞超微結構的變化，分析接種ERM真菌對桃葉杜鵑幼苗抗旱性影響，從而闡明接種菌根對植株抗旱性的作用效果。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗在貴州大學南校區林學院苗圃進行，屬于亞熱帶濕潤溫和型氣候，年平均氣溫在15.3 ℃左右，海拔1 100 m。

1.2 供試菌株

供試的2個試驗菌株為前期從野生桃葉杜鵑根系分離并篩選出的綜合促生能力和侵染率較強的菌株[13-14]:TY29(AB158314：Trametesochracea)，TY35(AB378554：Pochonia bulbill-osa)(括號中前者為國際GenBank中的登錄號，后者為與試驗菌株親緣關系最近種),由課題組分離保存。采用PDA液體培養基對試驗菌株進行培養，置于28 ℃搖床上振蕩(160 r/min)暗培養15 d，打碎并制成液體菌劑備用。

1.3 試驗苗木

試驗苗為通過播種繁殖培養的1年生桃葉杜鵑幼苗，采用播種繁殖，播種方法采用撒播，100粒每盆，于2015年12月播種后放入人工氣候箱內恒溫培養(白天、夜間都為25 ℃，濕度為90%、光照12 h)，2016年6月12日移栽到花盆中，每盆移植1株桃葉杜鵑幼苗，移栽成活后于每株苗根部各施入菌液5 mL，CK苗則做不澆菌液處理。同一個處理隨機擺放，各處理之間相互隔離，進行常規育苗方法管理。栽植花盆規格為90 cm×60 cm×80 cm(口徑×地徑×高)，土壤基質為腐殖土和石英砂按3∶1比例混合。

1.4 干旱脅迫處理

2016年8月選取生長一致的植株進行脅迫處理，每個處理15盆，每盆1株，各處理重復3次。用隨機區組試驗設計，因素A為接菌處理，設3個處理，分別是：TY29、TY35和對照CK；因素B為干旱脅迫處理，設4個脅迫梯度，按正常澆水(土壤含水率80%～90%，作為干旱脅迫的對照) 、輕度干旱(土壤含水率65%～75%) 、中度干旱(土壤含水率50%～60%)和重度干旱(土壤含水率35%～45%)進行處理。每天下午通過稱重法維持土壤相對含水量保持在試驗設計范圍內，其他管理一致，每天傍晚補足白天損失的水分，連續處理30 d后測定各指標。

1.5 樣品的制備觀察與測定

(1)取材與固定：水分脅迫30 d后，取幼苗相同部位須根根尖2 mm左右的小段，將樣品放入濃度為2.5%的戊二醛溶液中，在4 ℃條件下固定24 h以上。

(2)制片與觀察：將樣品取出，用pH為7.2的磷酸緩沖溶液漂洗3次，每次25 min，再經過30%、50%、70%、80%、90%和100%的乙醇脫水，每級停留30 min，然后用環氧丙烷置換過渡，Epon812滲透包埋，經超薄切片機切片后，用醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛對染，最后置于Hu212A透射電鏡下觀測須根根尖中柱細胞并拍照(桃葉杜鵑細胞超微結構制片與拍照均在上海交通大學分析測試中心進行)。

(3)指標測定：2016年8月對菌根侵率進行測定，植株收獲時菌根侵染率按Phillips[15]方法測定,涉及到的計算公式如下：

菌根侵染率=(菌根侵染的根段數/檢測的根段總數)×100%

(1)

菌根依賴性=(接種植株平均干質量/對照植株平均干質量) ×100%

(2)

菌根貢獻率=(接種植株平均干質量-不接種植株平均干質量)/接種植株平均干質量×100%

(3)

2 結果與分析

2.1 菌根侵染率

兩種ERM菌株的侵染率存在差異，其中TY35的侵染率比TY29的侵染率要高，未接種的CK處理幼苗根系侵染率為0，極顯著低于接種處理幼苗根系的侵染率。不同菌株對宿主植物根系表現出的親和力具有差異性，即反映出了宿主植物對不同菌根真菌的依賴性不同。接種苗的菌根依賴性均大于100%，TY35達到147.89%，菌根貢獻率為32.38%。TY29菌根依賴性達到118.23%，菌根貢獻率為13.65%。

2.2 正常水分條件下的根細胞超微結構

正常水分條件下，桃葉杜鵑各處理幼苗的須根中柱細胞結構相同，細胞完整，膜清晰，緊貼細胞壁，細胞呈梯形或近長方形，細胞器豐富，各細胞器的超微結構均呈正常狀態，位于細胞邊緣，液泡較大，位于細胞中央(圖1 a1、b1、c1)。桃葉杜鵑的線粒體呈圓形或橢圓形，雙層膜清晰可見，內嵴豐富，著色較深。此外，正常的細胞內還分布著由數個扁平囊泡垛疊而成的高爾基體(圖1 a2、b2、c2)。

a1，a2為CK根細胞與線粒體；b1，b2為TY29根細胞與線粒體；c1，c2為TY35根細胞與線粒體；CW：細胞壁；M：線粒體；G：高爾基體；放大倍數：a1×6 000;a2×20 000;b1×5 000;b2×20 000;c1×5 000;c2×20 000a1，a2:CK root cells and mitochondrial;b1，b2:TY29 root cells and mitochondrial;c1，c2:TY35 root cells and mitochondrial;CW:cell wall;M:mitochondria;G:golgi;Magnification:a1×6 000;a2×20 000;b1×5 000;b2×20 000;c1×5 000;c2×20 000圖1 正常水分條件下桃葉杜鵑幼苗根細胞超微結構Fig.1 Ultrastructure of root cells of Rhododendron annae seedlings under normal water conditions

2.3 輕度脅迫條件下的根細胞超微結構

輕度脅迫下，CK的須根中柱結構發生了變化，細胞膜結構受到一定的破壞，液泡內陷成許多小泡散布在細胞內部，多數細胞器開始向細胞中央聚攏(圖2 d1)。線粒體增多，且體積變得膨脹，外膜結構消失，內部嵴開始出現斷裂，片層結構紊亂，細胞中未見高爾基體的分布(圖2 d2)。TY29局部細胞膜破裂，中央液泡也開始破裂，細胞內容物都在降解，但程度較輕，各細胞器沒有貼壁分布(圖2 e1)。線粒體外膜結構變得模糊，內部嵴減少，出現較多的嗜鋨顆粒(圖2 e2)。TY35的細胞未出現變形，細胞膜局部破損，但內部細胞質基本正常(圖2 f1)。線粒體增多，雙膜結構明顯，內部嵴豐富，形態正常，高爾基體結構變得模糊，細胞內還出現了較多的淀粉粒(圖2 f2)。

d1，d2：CK根細胞與線粒體；e1，e2：TY29根細胞與線粒體；f1，f2：TY35根細胞與線粒體；CW：細胞壁；M：線粒體；Sg：淀粉粒；OG：嗜鋨顆粒；放大倍數：d1×10 000;d2×20 000;e1×5 000;e2×10 000;f1×8 000;f2×20 000d1，d2:CK root cells and mitochondrial;e1，e2:TY29 root cells and mitochondrial;f1，f2:TY35 root cells and mitochondrial;CW:cell wall;M:mitochondria;Sg:starch granules;OG:Osmium granule;Magnification:d1×10 000;d2×20 000;e1×5 000;e2×10 000;f1×8 000;f2×20 000圖2 輕度脅迫條件下的桃葉杜鵑幼苗根細胞超微結構Fig.2 Ultrastructure of root cells of Rhododendron annae seedlings under mild stress

g1，g2：CK根細胞與線粒體；h1，h2：TY29根細胞與線粒體；i1，i2：TY35根細胞與線粒體；CW：細胞壁；M：線粒體；N：細胞核；放大倍數：g1×10 000;g2×20 000;h1×10 000;h2×20 000;i1×6 000;i2×20 000g1，g2:CK root cells and mitochondrial;h1，h2:TY29 root cells and mitochondrial;i1，i2:TY35 root cells and mitochondrial;CW:cell wall;M:mitochondrial;N:nuclear;Magnification:g1×10 000;g2×20 000;h1×10 000;h2×20 000;i1×6 000;i2×20 000圖3 中度脅迫條件下的桃葉杜鵑幼苗根細胞超微結構Fig.3 Ultrastructure of root cells of Rhododendron annae seedlings under moderate stress

2.4 中度脅迫條件下的根細胞超微結構

隨著脅迫加劇，各處理苗的細胞結構變化愈加明顯，受傷害程度進一步加深。CK根細胞形態因失水變得收縮扭曲，細胞膜結構消失，細胞器結構遭到嚴重破壞，內含物流出，細胞核嚴重變形，核膜降解，細胞內染色質凝聚，細胞核降解為小碎片散布在細胞內部(圖3 g1)。線粒體體積進一步膨大，內部結構降解(圖3 g2)。TY29的根細胞變化程度小于CK，細胞輕微變形，膜破損，細胞內部基質凝聚成深色物質，細胞核外膜存在，但內部結構已經開始降解，與線粒體仍能較好的區分開來(圖3 h1)。線粒體外膜消失，內部結構模糊(圖3 h2)。TY35細胞膜開始降解，根細胞內部結構受到的傷害最小，細胞內部各細胞器能明顯區分，仍可見液泡結構，細胞核核膜完好，細胞核內部染色質開始凝聚，核仁開始降解(圖3 i1)。線粒體的外膜結構完好，內部嵴出現斷裂，片層結構紊亂(圖3 i2)。

2.5 重度脅迫條件下的根細胞超微結構

重度脅迫下，干旱處理對各幼苗根細胞的傷害進一步加深。CK的根細胞結構完全被破壞，細胞質、細胞器解體，細胞空泡化，僅留下一些細胞器的殘骸(圖4 j1、j2)。TY29的細胞壁出現斷裂，細胞內部細胞器也大量降解，僅存少部分殘存的線粒體，線粒體的內部結構也已經降解，內腔出現空洞(圖4 k1、k2)。TY35的根細胞整體形態較完整，細胞內部基質凝聚成深色物質，細胞核外膜存在，細胞內染色質凝聚(圖4 l1)。線粒體外膜仍較完整，嵴斷裂嚴重，內部結構開始降解(圖4 l2)。

j1，j2：CK根細胞與線粒體；k1，k2：TY29根細胞與線粒體；l1，l2：TY35根細胞與線粒體；CW：細胞壁；M：線粒體；N：細胞核；放大倍數：j1×10 000;j2×20 000;k1×5 000;k2×20 000;l1×10 000;l2×20 000 j1，j2:CK root cells and mitochondrial;k1，k2:TY29 root cells and mitochondrial;l1，l2:TY35 root cells and mitochondrial;CW:cell wall;M:mitochondrial;N:nuclear;Magnification:j1×10 000;j2×20 000;k1×5 000;k2×20 000;l1×10 000;l2×20 000圖4 重度脅迫條件下的桃葉杜鵑幼苗根細胞超微結構Fig.4 Ultrastructure of root cells of Rhododendron annae seedlings under serious stress

3 討論

菌根真菌能夠提高植物的抗旱性，因為菌根真菌在土壤中具有龐大的菌絲網，可增大植物的吸收面積，降低土壤與植物之間的液流阻力，促進根系對水分的吸收，并且菌套還能防止根系內水分的喪失，改善寄主植物的水分狀況，能夠或減緩植物體內水分缺失的加劇[3]，本實驗結果從細胞層次驗證了這一觀點，即接種菌根真菌在各種水分處理下，菌根真菌的形成一定程度上減緩植物體內水分的缺失，使植株受旱害程度減輕，從而保護了植物細胞的完整性。研究還發現，接種不同的菌株對干旱脅迫的響應也不同，原因可能是不同菌株對寄主植物的侵染程度有所不同，或者菌株之間的功能也存在差異。

在相同水分脅迫處理下，桃葉杜鵑根系細胞超微結構發生了不同程度的變化，但隨著水分脅迫程度的加強，桃葉杜鵑幼苗表現在細胞結構上的變化過程基本一致，由開始的根系細胞細胞膜破損,液泡膜破裂,類囊體腫脹，線粒體腫脹，基質變稀,脊減少，最終線粒體解體，其他細胞器消失，細胞空泡化。

在干旱脅迫條件下，比較觀察3種處理下桃葉杜鵑的線粒體、細胞膜、細胞核等細胞器超微結構的變化規律，是判斷其耐旱能力的方法之一。線粒體的形態結構、大小、數目和分布常因植物所處的環境條件不同而發生相應變化，尤其在逆境脅迫下其結構和生理功能的變化更為顯著[16]。在本實驗中，在輕度干旱脅迫下，3種處理植物根系細胞均開始受損，其中線粒體的損害程度：CK>TY35>TY29,細胞膜損壞程度：CK>TY29>TY35。此外水分脅迫下,淀粉粒很少見到，其原因是由于水分脅迫引起類囊體膜結構異常光合作用下降而導致光合產物減少，抑或因其被降解所致[17]，但TY35在輕度干旱脅迫下還能產生較多的淀粉粒,這樣既緩解了能量的短缺，保證細胞正常的生命活動。在中度干旱脅迫下，細胞受損程度進一步加深，CK苗外膜結構消失，細胞膜受損程度：TY29>TY35，細胞核受損程度：CK>TY29>TY35，線粒體的損害程度：CK>TY35>TY29，同時3種處理都出現細胞內染色質凝聚，其中CK苗內含物流出，細胞受到極大損害。在重度干旱脅迫下，CK苗細胞整個空泡化，TY29細胞出現小空洞，而TY35細胞結構仍完整。

4 結 論

水分脅迫顯著影響桃葉杜鵑幼苗的根系細胞超微結構，接種ERM真菌能在輕度、中度水分脅迫下提高桃葉杜鵑幼苗根系細胞結構穩定性，維持細胞膜、線粒體等細胞器的完整，緩解干旱脅迫對各細胞器的傷害效應。干旱脅迫下桃葉杜鵑幼苗細胞超微結構的傷害表現與抗旱性相關。接種TY29與TY35的幼苗的根系細胞超微結構的受損程度在輕度、中度水分脅迫下均小于菌根苗，但重度脅迫下各處理幼苗細胞結構都受到嚴重破壞，根據各處理苗細胞器的受損情況來評價各處理苗的耐旱能力，即菌根苗的抗旱性較強。