HPLC測定市售青風藤中青藤堿和木蘭花堿含量△

王青青，方明月，劉雙月，李德利，馬超，孫愛東*，王如峰*

(1.北京中醫藥大學 生命科學學院，北京 102488；2.北京林業大學 生物科學與技術學院，北京 100083)

青風藤為防己科植物青藤Sinomeniumactum(Thunb.)Rehd.et Wils.及毛青藤S.acutum(Thunb)Rehd.et Wils.var.cinereumRehd.et Wils.的干燥藤莖[1-2]。青風藤分布于長江流域及其以南各地，如河北、河南、安徽、江蘇、浙江、福建、廣東、廣西、湖北、四川、貴州、陜西等地[1]，毛青藤分布于湖北、四川、云南、貴州、陜西等地[2]。中醫應用青風藤或其復方治療風濕性疾病已有一千多年的歷史[3]，《圖經本草》和《本草綱目》中有記載“青風藤治風濕流注，歷節鶴膝，麻痹瘙癢……”[4]，《中華人民共和國藥典》(《中國藥典》)2015版一部收載青風藤，并在防己黃芪湯、芪麝丸等復方中藥中有所應用。青風藤中含有多種生物堿類化學成分，包括青藤堿、木蘭花堿、尖防己堿、四氫表小檗堿、異青藤堿、土杜拉寧、N-去甲基尖防己堿、白蘭花堿、光千金藤堿等30多個生物堿[4]，主要成分為青藤堿和木蘭花堿?！吨袊幍洹穂5]中收載了青藤堿的含量測定項，并規定青風藤中青藤堿的含量不得低于0.50%。木蘭花堿是青藤堿的同系物，二者都有類似的菲核結構[6](見圖1)，且藥理作用也相似[7-10]。因此，木蘭花堿的含量對青風藤的質量評價也有重要價值。為此，本文建立了同時測定青風藤中這兩個成分的含量測定方法，并利用該方法對從全國各地收集的62批市售青風藤中青藤堿和木蘭花堿的含量進行了測定。

圖1 青藤堿和木蘭花堿化學結構式

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters 2695高效液相色譜儀(Waters 公司)，BP211D 型 1/10 萬電子天平(Sartorious公司)，Synergi Polar -RP 苯基 C18色譜柱，KQ-500型數控超聲儀(昆山市超聲儀器有限公司)，400Y型多動能粉碎機(永康市鉑歐五金制品有限公司)。

1.2 試劑與藥品

62批青風藤飲片分別在2015—2018年購于全國14個省的藥材市場或中藥店，經北京中醫藥大學王如峰教授鑒定為正品，憑證標本保存于北京中醫藥大學生命科學學院，樣品信息見表1。青藤堿、木蘭花堿對照品購于賽譜銳思(北京)科技有限公司，其純度不低于99%。色譜試劑乙腈為色譜純(Fisher公司，美國)，乙酸和乙醇均為分析純，水為市售屈臣氏蒸餾水。

表1 62批青風藤飲片樣品信息

2 方法與結果

2.1 液相色譜條件及系統適用性試驗

色譜柱為 Synergi Polar-RP苯基C18柱(250 mm×4.6 mm，4m)，流動相為乙腈(B)-1%乙酸水溶液(A)，梯度洗脫(0～15 min，10%→15% B；15～17 min，15%→20% B；17～22 min，20%→40% B；22～30 min，40%→40% B)，柱溫為30 ℃，檢測波長為280 nm，流速為1 mL·min-1。采用上述色譜條件分別得到對照品和青風藤飲片提取液的HPLC色譜圖，如圖2所示。樣品中青藤堿、木蘭花堿的保留時間分別為10.50、21.72 min，理論塔板數分別為1532和6060，拖尾因子分別為0.98和1.01。

注：A.混合對照品；B.樣品；1.青藤堿；2.木蘭花堿。圖2 青風藤及對照品HPLC圖

2.2 對照品溶液制備

分別精密稱取對照品青藤堿10.06 mg和木蘭花堿10.03 mg，置于10 mL容量瓶中，加70%乙醇水溶液溶解并稀釋至體積，4 ℃保存備用。進樣前，取適量對照品溶液稀釋至0.1 mg·mL-1。

2.3 供試品溶液制備

稱取適量青風藤飲片，用粉碎機粉碎至粉末，過三號篩。精密稱取0.10 g，置于50 mL錐形瓶中，用移液管加入70%乙醇水溶液20 mL，稱質量。超聲提取30 min，放置室溫，再稱定質量，用70%乙醇水溶液補足減失的質量。搖勻過濾，取續濾液，用0.45m微孔濾膜濾過[4-5，11]，即得供試品溶液。

2.4 標準曲線制備

精密配制1 mg·mL-1的青藤堿和木蘭花堿對照品混合溶液，用70%乙醇水溶液分別稀釋得到質量濃度為0.01、0.025、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40 mg·mL-1的對照品混合溶液。按上述色譜條件測定，分別進樣10L。以測定峰面積(Y)為縱坐標，對照品濃度(X)為橫坐標進行線性回歸，得到回歸方程，青藤堿：Y=5×106X-3 780.8(r=0.999 6)，木蘭花堿：Y=1×107X+67 608(r=0.999 5)，結果表明青藤堿和木蘭花堿在0.01～0.40 mg·mL-1線性關系良好。

2.5 精密度試驗

精密量取按2.2項下方法制成的青藤堿和木蘭花堿對照品溶液，連續進樣6次，進樣量均為10L，測定青藤堿和木蘭花堿的峰面積。據此計算青藤堿和木蘭花堿色譜峰的RSD分別為1.26%和0.36%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩定性試驗

取同一供試品(編號：QF090ZK02)溶液，分別在0、2、4、8、12、24、48 h各進樣1次，進樣量均為10L，根據峰面積考察樣品的穩定性。計算得出青藤堿和木蘭花堿色譜峰的RSD分別為1.52%和1.83%，表明供試品在48 h內穩定。

2.7 重復性試驗

精密稱取供試品(編號：QF090ZK02)6份，按2.3制成供試品溶液，按2.1色譜條件分別進樣10L測定。計算青藤堿和木蘭花堿色譜峰的RSD分別為0.45%和0.93%，表明該方法重復性良好。

2.8 檢測下限與定量下限測定

按2.2制成兩種對照品溶液，逐漸稀釋，按2.1色譜條件連續進樣，記錄峰面積，直至S/N=3 和S/N=10，此時的進樣量即分別為檢測下限(LOD)和定量下限(LOQ)。測得青藤堿和木蘭花堿的檢測下限分別為0.64、0.72 ng，定量下限分別為2.05、2.40 ng。

2.9 回收率試驗

精密稱取同一供試品(編號：QF051AG14)6份，每份 0.10 g，分別定量加入2種對照品，按2.3法制成供試液，按2.1色譜條件，測定樣品中相應的生物堿含量，計算加樣回收率。青藤堿和木蘭花堿回收率分別為95.99%和99.11%，說明該方法的回收率良好。結果見表2。

表2 青風藤中青藤堿和木蘭花堿的加樣回收率試驗結果

2.10 含量測定

取62批市售青風藤飲片，按2.3制成供試品溶液，按2.1色譜條件每批測定3份，分別進樣10L，測得青藤堿和木蘭花堿的質量分數分別為0.236%～4.735%和0.256%～3.682%，結果見表3。

3 討論與結論

本研究建立了青風藤中青藤堿和木蘭花堿的 HPLC含量測定方法，并用該方法成功測定了來自全國各地的62批市售青風藤中青藤堿和木蘭花堿的含量。除了4批經性狀和顯微鑒定為混偽品未測出這兩個成分之外[12]，其余58批中青藤堿和木蘭花堿質量分數均值分別為2.034%和1.293%。青藤堿最高值為4.735%，最低值為0.236%，只有一批樣品的含量低于2015版《中國藥典》規定的最低0.5%的要求。木蘭花堿最高值為3.682%，最低值為0.256%。以上數據說明，2015—2018年市場上銷售的青風藤質量基本符合《中國藥典》要求，但存在混偽品和個別正品青藤堿含量不合格的現象，并且合格正品中青藤堿和木蘭花堿的含量差異也較大。正品青風藤中青藤堿和木蘭花堿含量差異較大可能與青風藤的產區跨度大及各地氣候、土壤、栽培條件存在差別有關。另外，入藥物種的差別也是造成不同批次中青藤堿和木蘭花堿含量差異的因素。

表3 62批市售青風藤中青藤堿和木蘭花堿的含量測定 %

注：—表示未檢測到。

經數據統計發現，青藤堿和木蘭花堿的含量大體上呈正比趨勢，青藤堿含量高的青風藤中木蘭花堿含量也相對偏高。這可能與兩個生物堿的結構相似、生物合成路徑也相似有關。本研究建立的同時測定青風藤中兩個生物堿的含量測定方法及測定結果，可為青風藤的質量評價提供科學參考。