SNP對鹽脅迫下南瓜種子萌發和幼苗光合碳代謝的影響

，

(1.齊齊哈爾大學生命科學與農林學院，黑龍江省抗性基因工程與寒地生物多樣性保護重點實驗室， 黑龍江 齊齊哈爾 161006；2.齊齊哈爾市衛生監督所， 黑龍江 齊齊哈爾 161005)

土壤鹽漬化作為一種非生物脅迫因子，已成為除干旱外影響作物生長發育、導致減產的第二大生態逆境。全球不同類型的鹽堿地達10億hm2，大約占可耕地面積的10%，我國的東北、西北、華北、新疆、甘肅等干旱和半干旱地區，鹽荒地和鹽漬化耕地面積達2×107hm2和6.7×106hm2，大約占可耕地面積的25%[1]。鹽害使植物水分平衡失調、物質代謝紊亂、光合機構受損。但植物細胞在長期進化過程中，也形成了一定的耐鹽和抗鹽機制。植物在幼苗階段對環境中的逆境信號感受最為敏感，而此時也是對其進行代謝調控的最佳生理活躍期。通過外源調控措施增強光合碳代謝，為氮代謝提供充足的碳架和還原力是改善和減輕鹽害的重要途徑。一氧化氮(NO)作為植物組織中廣泛存在的內源性信號分子，不僅參與了植物從種子萌發、形態建成、呼吸代謝、衰老和細胞程序性死亡(PCD)等生理過程，而且在植物對逆境脅迫的應答中發揮了重要的調節作用[1]。研究證實，外源NO通過提高抗氧化酶活性和抗氧化劑含量，降低活性氧(ROS)和過氧化產物丙二醛(MDA)的積累，增強了棉花(GossypiumhirsutumL.)幼苗的抗冷性[2]；緩解鎘脅迫對玉米(Zeamays)幼苗造成的生長抑制，增強其對鎘毒害的抗性[3]；誘導鹽脅迫下水稻(Oryzasativa)葉片的抗氧化酶活性，增加耐鹽相關基因的轉錄本[4]。而NO對鹽脅迫下南瓜幼苗早期碳代謝的影響未見報道。南瓜作為糧、菜、油、飼兼用作物，在我國的三北地區廣泛種植，尤其在東北，耕作層土壤的返鹽期和南瓜生長發育的苗期在時間上同步與疊加，造成苗期鹽害。本試驗以硝普鈉為外源分子信號——NO，研究其對鹽脅迫下供試材料南瓜種子萌發和幼苗早期碳代謝及相關酶活性的影響，探討外源NO緩解南瓜鹽脅迫的生理機制，探索提高南瓜耐鹽性的途徑。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試南瓜品種為銀輝2號[Cucurbitamoschata(Duch.)Yinhui2]，由齊齊哈爾市種子經銷處提供。NO供體為硝普鈉[Na2Fe(CN)5](Sodium nitroprusside，SNP)，購自Sigma公司，純度為98.5%。先配制成100 mmol/L母液，4 ℃保存，用時按所需濃度稀釋[5]。

1.2 實驗設計

1.2.1 種子萌發脅變設計

試驗于2014年3—7月在齊齊哈爾大學生化實驗室進行。精選大小和飽滿度一致的南瓜種子，先經0.1%的KMnO4消毒后，根據預試驗結果，用0，50，150，250 mmol/L的NaCl(對照、輕、中、重度脅迫)分別復合0，30，90，150μmol/L的SNP浸種6 h。試驗的10個處理分別以(N0S0、N0S30、N0S90、N0S150、N50S30、N50S90、N50S150，N150S30、N150S90、N150S150……N250S150)表示，將各處理置于人工氣候培養箱中(28 ℃，13 h/11 h光周期)發芽(30粒/皿)。為保持處理濃度恒定，各處理液平行定量補充。以胚根長2～3 mm為發芽標準，每天記載發芽種子數，第5天進行種子發芽參數的測定。

表1 外源NO對NaCl脅迫下南瓜種子萌發的影響(平均數±SE)

處理 發芽率 發芽勢 N0N50N150N250N0N50N150N250S087.49±1.38b88.16±3.67c57.32±1.02b29.41±2.04b47.13±2.59c39.12±0.87b30.51±2.64b26.34±1.07abS30 88.11±2.14b91.35±1.87b60.55±2.91b33.30±1.09ab 53.16±1.71b42.38±2.75b33.54±0.85b29.42±3.01aS90 89.95±2.37a93.41±1.07a76.34±1.98a40.69±2.03a56.94±2.88a48.26±1.96a41.88±2.77a28.87±0.92aS15084.67±0.90c75.79±2.34d51.49±0.89c20.08±1.22c45.89±1.58c29.78±2.00c20.175±0.59c19.56±2.64c

注：表中同列不同小寫字母表示p<0.05水平差異顯著。下同。

1.2.2 SNP濃度的篩選和苗期脅變處理

以預試驗中150 mmol/L的NaCl為影響種子萌發和幼苗生長的致害處理，分別添加0，30，60，90，120，150，180μmol/L的SNP，培養4 d后，南瓜幼苗相對生長量呈現隨SNP濃度遞增而先升后降的變化趨勢，其中選出相對生長量最大的90μmol/L SNP作為處理濃度。每處理重復3次，每次重復60粒種子。

將催芽后的種子播于細砂經高溫滅菌(130 ℃，3 h)的花盆中(12粒/盆)，于實驗室室溫下(23 ℃±2 ℃)自然光照培養，出苗后以Hongland營養液澆灌。待幼苗至3葉1心時，每盆保留生長整齊一致的幼苗8株，共30盆[5]。

試驗共設4個處理：分別為處理Ⅰ(對照)：Hongland營養液(ck)；處理Ⅱ：Hongland營養液+150 mmol/L的NaCl；處理Ⅲ：Hongland營養液+90μmol/L的SNP；處理Ⅳ：Hongland營養液+150 mmol/L的NaCl+90μmol/L的SNP。每天用相應的處理液定量澆灌2次(100 mL/盆/次)。分別于處理后的第4、8、12天進行光合碳代謝相關指標的測定，每次取樣4株，3次重復，隨機排列。

1.3 測定項目和方法

1.3.1 種子發芽參數的測定

發芽率(%)=(第5天發芽種子總數/供試種子總數)×100%；

發芽勢(%)=(第3天發芽種子總數/供試種子總數)×100%。

1.3.2 光合色素含量的測定

用乙醇丙酮混合液暗提取24 h，測定663、645、470 nm的光吸收值，計算葉綠素和類胡蘿卜素含量[6]。

1.3.3 碳代謝及相關酶活性的測定

可溶性糖含量的測定采用蒽酮比色法[6]；1，5-二磷酸核酮糖羧化酶(RuBPcase)和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPcase)活性分別采用偶聯法和比色法測定[7]。

1.4 統計分析

試驗數據用Microsoft Excel 2003軟件進行統計，所有數據以平均數±標準差表示，用SPSS 17.0軟件進行統計分析，用Duncan新復極差法進行多重比較(p<0.05)[5]。

2 結果與分析

2.1 外源NO對NaCl脅迫下南瓜種子萌發的影響

表1顯示，南瓜種子發芽率和發芽勢均隨NaCl濃度的升高而降低，N150S0和N250S0處理，發芽率分別降至對照的65.52%和33.61%，發芽勢降低了35.26%和44.11%(p<0.05)，說明中、重度鹽害顯著抑制了南瓜種子的萌發。復合30～90μmol/L的SNP浸種處理，不同程度提高了中、重度鹽脅迫下南瓜種子的發芽率，N150S30、N150S90和N250S30、N250S90處理發芽率分別較對照提高了5.64%、33.18%和13.22%、38.35%，90μmol/L的SNP處理均達差異顯著水平(p<0.05)。N150S90處理，南瓜種子發芽勢達對照的1.37倍(p<0.05)，但對重度脅迫處理，發芽勢僅提高了9.61%，未達到差異顯著水平(p<0.05)。復合高劑量SNP(150μmol/L)浸種，發芽率和發芽勢呈同步下降趨勢。說明適宜濃度外源SNP可以有效緩解中度鹽害對南瓜種子萌發造成的傷害，促進種子萌發，但過高濃度則產生抑制效應，加重鹽害。

2.2外源NO對NaCl脅迫下南瓜幼苗葉片葉綠素、類胡蘿卜素含量的影響

葉綠素是光合作用中最有效和最重要的色素，其含量在一定水平上影響南瓜苗期同化外源物質和進行光合積累的能力，并最終影響南瓜產量[5]。由圖1可見，正常生長條件的南瓜葉片葉綠素和類胡蘿卜素含量隨幼苗生長而逐漸升高。單純鹽脅迫，葉綠素和類胡蘿卜素含量均顯著下降。處理4 d時，分別較對照下降了21.88%和24.64%，處理結束后，檢出率僅為對照的72.59%和62.82%(p<0.05)，說明鹽脅迫使南瓜葉片的光合機構受損，電子傳遞和光合磷酸化的偶聯機制遭到破壞。且從變化趨勢上看，處理達8 d時，葉綠素和類胡蘿卜素含量仍為正增長，增幅分別為11.54%和9.62%；處理后12 d時，已呈負增長態勢，分別較8 d處理下降了7.39%和14.03%，但葉綠素含量仍高于處理初期，而類胡蘿卜素含量僅為初期處理的94.23%。單純SNP處理，顯著提高了光合色素的含量水平。但兩者不同的是，葉綠素含量在處理初期和中期(4～8 d)顯著升高，分別比對照增加了12.02%和11.74%(p<0.05)，此后升幅減小(8.11%)但仍顯著高于對照；而類胡蘿卜素含量則在(4～8 d)時與對照差異不顯著，后期大幅升高，增幅達23.08%(p<0.05)。復合SNP后，顯著提高了鹽害下南瓜葉片的光合色素含量。處理后4 d時，葉綠素和類胡蘿卜素含量分別比鹽脅迫提高了12.64%和21.15%；處理結束時，增幅已分別達到鹽害的42.02%和85.71%(p<0.05)。

圖1 外源NO對鹽脅迫下南瓜幼苗葉片光合色素含量的影響

圖2 外源NO對鹽脅迫下南瓜葉片可溶性糖含量(a)、RuBPcase(b)和PEPcase(c)活性的影響

2.3外源NO對NaCl脅迫下南瓜幼苗葉片可溶性糖含量、RuBPcase和PEPcase活性的影響

150 mmol/L NaCl脅迫，南瓜葉片可溶性糖含量在處理初、中期(4～8 d)顯著高于對照，隨幼苗生長，處理結束時已降至對照水平。單純SNP處理，可溶性糖含量隨幼苗發育而升高，各處理時段均顯著高于對照。SNP復合處理4～8 d，可溶性糖含量分別較鹽害下降低了18.86%和13.33%，后期比鹽脅迫提高了21.56%。說明外源NO調控了碳流運轉，將前期滲透調節積累的糖經蘋果酸-草酰乙酸(MAL-OAA)穿梭，為谷氨酸的轉化提供碳架——α-酮戊二酸(α-KG)的同時，將產生的NADH通過迅速還原NO3-，促進了碳流由碳代謝向氮代謝的轉換。RuBPcase是催化光合碳代謝中CO2固定的關鍵酶，其活性高低對光合速率產生重要影響。PEPcase是催化三羧酸循環回補反應的重要酶。正常生長條件下，RuBPcase、PEPcase活性隨南瓜幼苗生長而提高；SNP不同程度提高了RuBPcase活性，但4～8 d時與對照差異不顯著，后期處理比對照高18.31%，達差異顯著水平，而PEPcase活性則與對照無差異。鹽脅迫使RuBPcase活性呈逐漸下降的趨勢。PEPcase活性在處理初期較對照下調了35.76%，8 d處理酶活略有回升，但處理結束時PEPcase活性仍下降至僅為對照的51.74%；SNP復合后，RuBPcase活性增幅由單純SNP處理的18.60%上升到復合鹽害逆境下的82.35%、PEPcase活性則由初始處理的29.19%進一步上調至處理結束時的46.47%(圖2)。說明NO作為分子信號能有效啟動南瓜幼苗對逆境的應答，有助于提高鹽脅迫下南瓜幼苗光合碳同化能力的提高和碳流的轉化。

3 討 論

從自由基傷害學說的觀點出發，鹽害逆境下，南瓜種子和幼苗ROS的產生和清除系統失衡，ROS的積累誘發膜脂過氧化，葉綠體的類囊體膜是對環境最為敏感和脆弱的生物膜，鹽害造成葉綠體膜結構受損，葉片的光合損傷導致2種光和色素含量下降。此外，鹽環境下葉綠素酶活性升高，加速葉綠素的降解也是導致光和色素含量下降的重要原因。外源SNP顯著提高了鹽害環境下南瓜葉片的葉綠素及類胡蘿卜素含量，說明SNP作為活性氮能有效修復類囊體膜的結構損傷，促進膜蛋白復合體的穩定，降低葉綠素酶的活性，緩解了光合色素的下降，增強了南瓜幼苗光合碳代謝的能力。試驗結果表明，90μmol/L的SNP浸種，能顯著提高鹽脅迫下南瓜種子的發芽率和發芽勢，顯著緩解了鹽害導致的幼苗可溶性糖堆積，提高了碳同化酶RuBPcase、PEPcase的活性，光合碳同化的正常進行為氮代謝提供了豐富的碳架和還原力，促使了碳流向氮代謝方向運轉，提高了幼苗的耐鹽性，促進了南瓜幼苗的早期發育和形態建成。