珍稀瀕危植物五小葉槭ISSR-PCR反應體系的建立和優化

郝云慶，羅曉波，王曉玲

(1.成都信息工程大學資源環境學院,四川 成都 610225;2.四川省自然資源科學研究院,四川 成都 610041；3.峨眉山生物資源實驗站，四川 峨眉山 614201；4.涼山州勞動職業技術學校,四川 西昌 615000)

五小葉槭(Acerpentaphyllum)，是中國四川特有物種，屬于槭樹科，槭屬落葉喬木。根據IUCN瀕危等級標準(IUCN 1994)，該種已屬于極危物種[1～2]。目前為至，僅在四川省雅江縣米龍鄉[2]，九龍縣三巖龍鄉和呷爾鎮洛莫村[3]，康定縣普沙絨鄉，以及木里縣卡拉鄉5處發現有分布。近年來，隨著分子生物學技術的發展，建立在PCR基礎上的各種分子標記技術在珍稀瀕危動植物保護中得到越來越廣泛的應用[4～6]。分子標記可在分子水平上直接反應物種遺傳多樣性[7～9]。RFLP、RAPD、SSR、CAPS和ISSR等是目前常用的分子標記[10～12]。

簡單序列重復區間擴增多態性(Inter Simple Sequence Repeat，ISSR)是Zietkiewicz等創立的一種新型的分子標記技術[12]。它綜合了其他分子標記技術的優點，比RFLP、RAPD和SSR反映更豐富的多態性；ISSR分子標記為顯性標記，穩定性較好，無需知道物種SSR背景，一套ISSR引物可以在多個物種中共用，保證PCR擴增反應的重復性[13～16]。因而，ISSR分子標記技術已經被廣泛用于物種鑒定及分類、親緣關系鑒定和遺傳多樣性分析當中[17]，從而為探討珍稀瀕危動植物種群的進化機制，預測小種群未來發展趨勢起著至關重要的作用。

確定PCR反應最佳的反應體系是ISSR分子標記成功與否的關鍵[18]，能為下一步研究打下良好基礎。目前，大部分反應體系通常分別研究Taq酶、Mg、dNTPs、引物和DNA模板共5個因素對反應的影響，通常處理多，工作量比較大，分析繁雜。本文中采用目前市面上的PCR反應預裝混合液Master Mix，對Taq酶、dNTPs和Mg2+這3個因素綜合考慮，這樣既可以減少試驗因素，又能獲得較好的試驗結果[10]。五小葉槭ISSR-PCR反應體系的優化目前尚屬研究空白，本研究旨在從DNA模板、引物和Master Mix共3個因素優化五小葉槭ISSR-PCR反應體系，為進一步對五小葉槭種群遺傳多樣性分析和保護遺傳學研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

分別在雅江縣米龍鄉，九龍縣三巖龍鄉和呷爾鎮洛莫村，康定縣普沙絨鄉，以及木里縣卡拉鄉5處五小葉槭居群采集葉片組織樣品(各樣本間距離>20 m)，不同植株隨機選擇3～5片無病蟲害新鮮幼嫩葉片，硅膠快速干燥保存備用。提取五小葉槭基因組DNA試劑盒，以及用于ISSR-PCR反應的2x Master PCR Mix，DL2000 Marker和ISSR引物均購置于北京擎科新業生物技術有限公司(www.tsingke.net)。所選用的ISSR引物根據加拿大哥倫比亞大學(UBC)公布的第9套ISSR引物序列進行初步篩選，選擇UBC807(AGA GAG AGA GAG AGA GT)正交實驗引物固定引物，UBC809(AGA GAG AGA GAG AGA GG)作為最佳反應條件驗證引物。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取和檢測

采集的五小葉槭葉片選用北京擎科新業生物技術有限公司植物基因組DNA提取試劑盒進行DNA的提取，操作步驟按照試劑盒說明書進行。配制0.8%的瓊脂糖凝膠進行五小葉槭基因組DNA完整性和濃度的檢測。將DNA模板濃度統一稀釋至50 ng/μL，將稀釋好的DNA保存于-20℃備用。

1.2.2 ISSR-PCR各反應因素的確定

試驗采用2X Master PCR Mix，里面包含有dNTPS，Mg2+以及Taq酶，減少了反應影響因素，可以較好的控制實驗，對試驗進行綜合評價。對影響ISSR-PCR反應的3個因素(DNA模板，引物和Mix)，按照L9(33)三因素三水平進行正交實驗(見表1)。

表1 五小葉槭ISSR-PCR反應體系各因素水平Tab.1 The levels and factors of ISSR-PCR reaction system

1.2.3 ISSR-PCR擴增測序及擴增產物檢測

PCR反應采用25 μL擴增體系，各反應如表2所示，用ddH2O補足25 μL。 PCR擴增程序為： 94℃預變性5 min， 94 ℃變性30 s， 52 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min30 s，35個循環，72 ℃總延伸5 min，8 ℃保存。取10 μLPCR擴增產物用2%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。

表2 PCR反應因素水平的L9(33)正交設計方案Tab.2 L9(33) orthogonal design for different factors and levels of PCR reaction

2 結果與分析

2.1 DNA提取結果檢測

本次實驗一次性同時提取6份不同個體五小葉槭葉片DNA。電泳結果顯示，提取DNA效果較好，點樣孔干凈，無蛋白污染，條帶清晰單一，濃度較高，無明顯降解，比較完整(見圖1)。

2.2 ISSR-PCR擴增產物檢測及評分

按照表正交設計的9個處理進行PCR擴增，為了減少試驗誤差，每個處理設置3個重復。從瓊脂糖凝膠電泳結果看出9個反應均出現擴增條帶(見圖2)。根據電泳結果，將9個處理從高到低依次打分(見表3)。條帶清晰度高、數量豐富、背景干擾低的最優產物記為9分，而最差產物記為1分，3個重復分別獨立統計。

圖1 DNA提取電泳圖 M為DL2000 Marker，1～6為份不同個體五小葉槭葉片DNAFig.1 The extraction of template DNA

圖2 ISSR-PCR反應擴增產物電泳結果圖 A，B，C為3個重復結果，1～9為表2中對應的9個處理，M為DL2000 MarkerFig.2 ISSR-PCR reaction effect of agarose gel electrophoresis.A,B,C mean three repeats

表3 正交設計中9個處理綜合評分結果Tab.3 Scores of 9 treatments in orthogonal

2.3 各因素之間對五小葉槭ISSR-PCR反應影響差異分析

上述各處理評分結果利用DPS 7.05統計軟件進行方差分析(見表4)。從F值可以看出，引物濃度對五小葉槭ISSR-PCR反應影響最大，其次為模板DNA濃度。各因素水平變化對ISSR-PCR反應影響順序為：引物>DNA模板>Master Mix。并且各因素水平間的差異均達到極顯著水平，因而可以更進一步對各因素內進行多重比較分析。

表4 五小葉槭ISSR-PCR反應各因素間方差分析Tab.4 Analysis of variance among factors

2.4 因素內各水平對五小葉槭ISSR-PCR擴增結果的影響

為了獲得各水平最優的反應條件，對各因素內進行多重比較分析。由F值可知，引物濃度為3個優化因素中對PCR反應影響最大的。在25μL反應體系中，引物濃度為0.4 μmol·L-1、0.8 μmol·L-1、1.2 μmol·L-13個水平間差異達到極顯著水平，在引物濃度為0.8 μmol·L-1水平時表現最好。因此，確定引物濃度為0.8 μmol·L-1作為最佳反應引物濃度。

DNA模板濃度在影響五小葉槭ISSR-PCR反應的因素中處于第2位。在25 μL反應體系中，DNA模板為50 ng、100 ng、150 ng這3個水平間差異達到極顯著，且隨著模板量增加，反應平均得分降低。由此，選擇50 ng的DNA模板用量作為最佳水平。

雖然根據方差分析，Master Mix用量對PCR反應結果影響最小，但是根據25 μL反應體系中，Master Mix用量為13.5 μL時得分最高。因而，選用13.5 μL作為Master Mix的最佳用量(見圖3)。

圖3 因素內各水平間與評分均值關系Fig.3 The relationship between the levels of the factors and the mean score

2.5 對最佳反應體系的驗證

用ISSR引物UBC809對6份不同個體的五小葉槭進行反應最佳體系驗證，瓊脂糖凝膠電泳結果顯示擴增條帶清晰，重復性好。上述最佳反應體系可進行下一步五小葉槭群體遺傳多樣性研究(見圖4)。

圖4 ISSR-PCR最佳反應體系驗證結果M為DL2000 Marker，1～6為引物UBC809擴增6份不同五小葉槭DNA模板電泳結果Fig.4 The verification results of the optimized ISSR-PCR system

3 結論與討論

ISSR分子標記技術是基于PCR反應基礎上的分子標記技術，目前通常以DNA模板、引物濃度、Mg2+、dNTPs以及taq酶為主要因素研究其對PCR反應的影響，并確定最佳適合研究材料的反應體系[19～20]。利用2X Master Mix將Mg2+、dNTPs以及taq酶這3個因素進行綜合考慮，進行ISSR-PCR試驗還未見有人報道。本試驗采用2X Master Mix，減少試驗誤差，提高效率，增強穩定性。采用正交設計的方法，對影響PCR反應的DNA模板、引物和Master Mix共3個因素進行優化，通過DPS統計軟件分析結果表明各因素水平變化對ISSR-PCR反應影響順序為：引物>DNA模板>Master Mix，并最終確立五小葉槭ISSR-PCR最佳反應體系(25 μL)為1 μLDNA模板(50 ng·μL-1)、2 μL引物(10 μM)和13.5 μL Master Mix。同時通過最佳體系驗證試驗，結果穩定，條帶清晰。這就為應用ISSR分子標記技術進行五小葉槭的遺傳多樣性研究奠定技術基礎。

結果表明，五小葉槭種群間基因分化系數Gst為0.3722，遠遠高于Hamrick和Godt(1989)統計的長壽命木本植物Gst平均值(0.073)，這說明五小葉槭種群起源較為古老，種間分化已達到了較高的水平。

五小葉槭屬于雅礱江中游干旱河谷地區的特有物種，對干旱河谷環境的適生性普遍優于其它物種，因此，這樣的特化也使它的分布僅局限于這一狹窄的區域?？梢?，五小葉槭的致危因素并不是來自于其它物種種間競爭的壓力。在實地調查中也發現，五小葉槭種群不會形成單一優勢種的群落結構，而是與多種物種呈共優的局面；所以，五小葉槭群落的保育也不必追求單一優勢種的群落結構。調查發現，五小葉槭的結實能力較強，種子散落后也能完成自然萌發，只是因旱季水分虧缺當年實生苗很難越冬存活。這是其自身生物學特性所致，與其它物種的競爭沒有直接相關。