大腸桿菌ABC轉運體研究進展

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ABC轉運體是所有轉運體家族中最大的一類轉運體，廣泛分布于從原核生物到人類的幾乎所有的物種中。大部分的ABC家族轉運體都是跨膜蛋白質，通過偶聯ATP的水解釋放的能量轉移底物。這些蛋白質組成了古老的轉運體家族，其進化時間超過30億年。系統發生方面的證據支持ABC家族的分歧時間早于細菌、古細菌和真核生物的分歧時間，許多人類的ABC轉運體與某些細菌如大腸桿菌的ABC同源。

不同類型的ABC轉運體轉運不同的底物，從小分子如離子、糖或氨基酸到大分子如抗體、藥物、磷脂和寡肽等。在細菌中ABC轉運體參與營養物質的攝取或細菌毒素的分泌以及將抗生素泵出細胞使細菌具有抗藥性；在植物中，ABC家族轉運體參與對除草劑的抗性[1]；在人類中，ABC家族基因突變會導致功能改變，與一些遺傳病如囊性纖維化有關，另外ABC家族轉運體的上調表達與腫瘤細胞的耐藥性有關。ABC家族的蛋白質不僅參與物質的跨膜運輸，也參與除轉運以外的其它功能如mRNA轉錄及DNA損傷修復等[2-3]。

1 大腸桿菌的ABC轉運體

大腸桿菌是革蘭氏陰性菌，是包括人類在內許多動物的腸道正常菌群。大腸桿菌K-12菌株，是一個非毒力缺乏O-抗原和K-抗原并在實驗室廣泛使用的菌株，常被認為是大腸桿菌培養的標準菌株。1997年大腸桿菌K-12菌株完成全基因組測序，在其基因組中最大的蛋白質家族是ABC轉運體家族，發現了至少72個編碼ABC家族蛋白的基因，占整個基因組的5%[3]。這個龐大的轉運體對于維持大腸桿菌正常的營養吸收及代謝產物的排出是非常重要的。而在人類基因組中只有48個ABC轉運體，金黃色葡萄球菌、果蠅、擬南芥分別有28、56、113個ABC轉運體系統。除植物外，真核生物較原核生物含有較少的ABC系統。如果基因組中ABC系統數量多，說明這個生物有更多的底物被運進或運出。因此在真核生物中，能運動的生物體如動物較不能運動的生物如植物需要較少的ABC轉運體。因為能運動的生物含有較豐富的主動運輸系統保證營養物質的供給和代謝產物的排出。

2 大腸桿菌ABC轉運體分類

目前大腸桿菌ABC超家族根據研究進展及功能分為3類。第一類為攝取系統，該類轉運體將胞外的物質運輸到細胞內，是大腸桿菌獲取營養的主要途徑，該類轉運體包括已經被實驗證實的攝取系統共41個(見表1)，其中研究比較清楚的包括大腸桿菌VB12攝取系統BtuCDF轉運體，HisJMPQ組氨酸轉運體，OppABCDF寡肽轉運體等，還有16個預測的ABC攝取系統，即這16個攝取系統目前為止功能還不清楚(見表2)[4]。第二類為輸出系統，這類轉運體的底物主要包括細胞內合成的需要或能夠運輸到胞外執行功能的蛋白質，例如胞外的外周蛋白，細胞壁的主要成分磷脂及脂多糖等都是依賴ABC轉運體外排到胞外的，外排的底物還包括重金屬、大腸桿菌產生的溶血素、小菌肽、大腸桿菌素及抗生素等，大腸桿菌的外排轉運體有11個(見表3)[3]，其中有一部分是根據結構域預測的。這些ABC外排泵對于大腸桿菌適應不良環境起非常重要作用。大腸桿菌外排系統研究較為清楚的包括LolCED負責脂蛋白在內外膜間的翻轉[5]；MsbA在相關功能研究之前預測為與細菌抗藥性有關的外排系統，但是經功能研究之后發現該系統不但與多藥抗性有關，還負責將細胞質合成的類脂A(lipid A)轉運到膜周間隙中[6]；脂多糖的外排系統LptAB[7]；溶血素外排系統HlyAB[8]；大腸桿菌素外排系統CvaAB[9]；亞鐵血紅素外排系統CcmAB[10]；YojI 轉運體負責小抗菌肽J25的外排[11]；以及與大環內酯類藥物外排有關的macAB等[12]。輸出系統的大部分成員功能還未知；第3類為與物質運輸無關的系統(見表4)。參與mRNA轉錄、DNA損傷的修復等，因此有人將ABC超家族翻譯成ABC系統。因為并不是所有的ABC家族成員都參與一定底物的轉運。大腸桿菌的非轉運體預測的有4個，這類轉運體典型的代表為UvrA，是目前為止已知的唯一一個與轉運沒有關系的ABC家族成員。UvrA系統在紫外線誘導的DNA損傷中起到修復DNA的作用[13]。

3 大腸桿菌ABC轉運體的結構

所有的ABC轉運體無論是攝取或輸出轉運體都有相似的結構，即包含整合膜蛋白構成的2個跨膜結構域(MD)和2個核苷酸結合結構域(NBD)，在許多細菌中，這4個結構域分別由不同的基因編碼，如大腸桿菌的麥芽糖轉運體復合物MalEFGK[14]和核糖轉運體復合物RbsBCD[15]，而在有些細菌和真核生物中這4個結構域可能由一個基因編碼，同時包含1個NBD結構域和1個MD結構域，2個這樣的蛋白形成二聚體發揮功能，這樣的ABC轉運體稱為半轉運體如大腸桿菌的磷脂A和多藥外排轉運體MsbA[7]，也有些ABC家族轉運體由1個基因編碼同時含有2個NBD結構域和2個MD結構域，這樣的轉運體稱為全轉運體，如人類的腫瘤抗藥性轉運體P-型糖蛋白就是1個典型的ABC家族的全轉運體[16]。在過去的10年里來自于不同細菌的45個不同的ABC轉運系統有91個ABC晶體結構被報道，其中35個是SBPs結構，另外56個晶體結構是NBD結構和全長的轉運體結構。后56個包含5個來自于4個不同的轉運體和51個NBD結構域，其中NBD結構域中13個是以二聚體形式存在，另外的38個都是單體[17-27]。

3.1核苷酸結合結構域 ABC轉運體的NBD結構域保守性較強，在幾乎所有的ATP結合蛋白中都包括保守的Walker A和Walker B結構域，而信號結構域(LSGGQ)只出現在ABC轉運體家族中。NBD結構域是ABC轉運體的馬達結構域，能結合并水解ATP產生的能量誘導NBD構象改變，迫使NBD結構域相互靠近并與ATP形成三明治結構，這些改變傳遞給MD結構域，引起其構象改變，使其向內或向外開放，從而使底物輸入到胞外或胞內。

基于已經獲得的晶體結構，一般的NBD結構域包含3個部分：α螺旋結構域，1個催化結構域和1個調節結構域。而α螺旋結構域和催化結構域在所有的NBD結構域中都存在，只有在CysA,GlcV和MalK轉運體中存在額外的調節結構域。所有的ABC轉運體的NBD結構域包含高度保守的結構域如Walker A (GXXGXGKS/T with X 代表如何氨基酸) 和 Walker B (ΦΦΦΦD with Φ 代表輸水氨基酸殘基)，這2個motif包含了ATP識別和結合的位點[28]，而信號結構域(signature motif LSGGQ，也叫做C-loop或LSGGQ motif)只出現在ABC轉運體中是ABC轉運體的標志性結構域，在NBD形成的二聚體中順向NBD的Walker A motif與反向NBD的signature motif 與ATP的□-磷酸結合形成催化結構域。

表1 大腸桿菌中已經被證實的輸入系統(41個)Tab.1 Experimentally confirmed import system

NBD結構域還包含A-環(A-loop)，Q-環(Q-loop)，D-環(D-loop)和H-環(H-loop也叫做switch loop)僅由一個保守的氨基酸殘基組成。組成A-環的氨基酸殘基為芳香族的氨基酸殘基，通常是酪氨酸，對于ATP與NBD結構域的結合起輔助作用[29-30]；組成Q-環的氨基酸殘基為谷氨酰胺，與ATP’s的γ-磷酸結合；組成Q-環的氨基酸殘基為組氨酸，與ATP’s的γ-磷酸直接結合。在全長的ABC轉運體中Q-環即與MD結構域結合又與ATP結合，在NBD和MD結構域的構象偶聯中起重要作用[26，31]。

ATP與一個核苷酸結合位點水解引起NBD的二聚化，但是2個位置的水解需要ATP與NBD形成三明治樣結構[32]。ATP的結合、水解及ADP的釋放誘導NBD結構域構象的變化，NBD構象的變化誘導MD構象也發生變化從而完成底物的轉運。

3.2ABC轉運體的跨膜結構域 與保守的NBD結構域相比，跨膜結構域(MD)的保守性較差[33]，這與MD結構域參與不同底物轉移的功能有關。在ABC外排轉運體中，全長的轉運體含有2個MD結構域形成1個二聚體結構，包含12個跨膜的α螺旋，而ABC攝取轉運體中，跨膜α螺旋數量不同，10～12個跨膜螺旋可能是底物跨膜轉移的最小數量。許多ABC外排泵的MDs都有2個位于細胞外的環和2個位于細胞質基質的環。在金黃色葡萄球菌多藥外排轉運體Sav1866 同源二聚體結構中，位于細胞質基質內有2個短偶聯螺旋形成的環(ICL1和ICL2)與細胞膜平行并與NBD結構域相互作用[34]。第一個偶聯螺旋(ICL1)可以同時與2個NBD結構域結合，而第2個偶聯螺旋(位于ICL2) 專一的與半轉運體對面的NBD結構域結合[35]。在NBD結構域中Q-環提供了與偶聯螺旋相互作用的氨基酸殘基。NBD結構域中有1個保守的位于X-環(X-loop)谷氨酸鹽可以同時與兩個偶聯螺旋結合被認為在NBDs與MDs的相互作用中起重要作用[35]。NBD和MD偶聯的確切機理還不清楚。

3.3底物識別結構域 攝取系統而不是輸出系統通常包含可以與底物識別和結合的底物結合受體(solute-binding receptors，SBP)，一個系統通常含有一個或多個底物結合受體，在革蘭氏陰性菌中底物結合受體位于細胞周質(periplasm)，革蘭氏陰性菌如大腸桿菌的原核型ABC轉運體的基質結合蛋白和自由狀態的基質結合蛋白在胞外空間含量較高。其比例遠高于可能與他們結合的ABC轉運體?？赡茴~外的SBPs能夠結合可能結合的任何底物，經SBPs將底物交給附近的ABC輸入泵完成底物轉運。在革蘭氏陰性菌的外排泵中需要確保ABC轉運體與外膜蛋白結合便于穿過膜周間隙的轉運，如大腸桿菌外排溶血素系統HlyB[8]。HlyB轉運體轉移溶血素時與外膜蛋白TolC相互作用，在外膜與膜周間隙形成一個跨膜轉移溶血素的外排系統。

在革蘭氏陽性菌中缺乏外膜的SBPs暴露在細胞表面，因此底物結合受體既可以是脂蛋白也可以位于細胞質膜外，或細胞表面相關蛋白，底物結合蛋白分為6個亞家族[36]。SBP與MT和NBD形成的同源或異源二聚體的N端或C端結合，因此2個或更多的SBP可以與二聚體結合可以促進轉運效率。而有些特殊的高度親和的ABC家族的攝取系統如維生素、礦物質和其他小分子攝取系統叫做ECF系統，缺乏細胞外的受體[37]。

大腸桿菌是最簡單的模式生物，對其它ABC家族轉運體系統進行研究不僅可以了解該物質ABC家族轉運系統的轉運機制，同時也可以為其他物種的相關研究提供理論參考，大腸桿菌的外排泵家族中有一部分與其抗藥性有關，對這些外排泵的深入研究對于解讀人類的抗腫瘤藥物的外排有一定的幫助。