1株腈水合酶產生菌株的篩選、鑒定及酶學特性

,, , , ,, ,,*

(1.魯東大學生命科學學院,山東煙臺 264025; 2.魯東大學農學院,山東煙臺 264025)

對羥基苯乙酰胺是合成腎上腺素受體阻滯藥阿替洛爾及其衍生物的關鍵中間體,因此對羥基苯乙酰胺的合成一直廣受關注[1-4]。對羥基苯乙酰胺的生產方法主要有化學合成法和生物轉化法?；瘜W合成法反應條件劇烈,需要強酸、高溫等條件,容易發生副反應、收率低、污水難以處理、環境不友好,限制了在規?；I生產中的應用[5-6]。而生物轉化法通常常溫常壓下反應、條件溫和、催化專一性強、對應選擇性高,將會是工業生產對羥基苯乙酰胺的最佳選擇[7-9]。腈水合酶(Nitrile hydratase,NHase)是一種金屬酶,可以催化腈類物質合成酰胺類化合物,是實現生物轉化法生產對羥基苯乙酰胺的關鍵因素[10]。

NHase廣泛存在于微生物群體中,在紅球菌[11](Rhodococcussp.)、假單胞菌[12](Pseudomonassp.)、假諾卡氏菌[13](Pseudonocardiasp.)、農桿菌[14](Agrobacteriumsp.)、芽孢桿菌[15](Bacillussp.)、棒桿菌[16](Corynebacteriumsp.)及短桿菌[17](Brevibacteriumsp.)等微生物中均有發現,研究較為廣泛。Nitto公司采用3株產NHase的微生物生產丙烯酰胺,產量得到不斷提高。但也發現所產NHase不穩定,易失活,且受底物及產物的抑制作用較為強烈[18]。趙愛民等[19]利用篩選到的一株產NHase馬紅球菌(Rhodococcusequi),對其合成NHase的發酵條件進行優化,酶活較初篩時提高約95倍。馬士忠等[20]篩選出一株底物廣譜性的NHase的產生菌株諾卡氏菌KY1023,能高效地催化乙腈和丙烯腈的水解,分別轉化為相應的酰胺化合物,轉化率均超過98%。微生物NHase雖然具有很好的催化活性,在工業上僅限于丙烯酰胺和煙酰胺的生產,仍未廣泛地應用于其他腈類化合物,主要因為這些微生物NHase的酶活不夠高,半衰期短、對應選擇性和反應濃度不高,尚不具備工業價值[21]。通過篩選針對性底物的新型微生物NHase或可解決以上問題。

截至目前國內外對阿氏芽孢桿菌(Bacillusaryabhattai)的開發利用較少,研究發現它可用作土壤益生菌和香草醛生產菌株,尚未見該菌產NHase的相關報道。本研究室從濟寧農田土壤中分離出一株較高NHase活性的菌株,對其進行種屬鑒定和NHase酶學特性研究,為NHase的產業化生產及酶法制備酰胺化合物奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

微生物分離樣品 采集自濟寧農田土壤;細菌基因組DNA提取試劑盒、聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)產物純化試劑盒 北京鼎國生物技術有限責任公司;Taq DNA聚合酶 TaKaRa公司;細菌微量生化鑒定管 北京奧博星生物技術有限責任公司;豆粕水解液 山東陽成生物科技公司;其他試劑均為分析純 國藥集團化學試劑有限公司。

分離平板培養基:葡萄糖10 g/L,對羥基苯乙腈4 g/L,蛋白胨10 g/L,酵母浸粉5 g/L,MgSO40.1 g/L,KH2PO40.2 g/L,CoCl20.05 g/L,瓊脂20 g/L,pH7.0;斜面保藏培養基:酵母浸粉5 g/L,蛋白胨10 g/L,NaCl 5 g/L,瓊脂20 g/L,pH7.0;基礎發酵培養基:葡萄糖20 g/L,對羥基苯乙腈2 g/L,蛋白胨5 g/L,酵母浸粉5 g/L,豆粕水解液10 g/L,MgSO40.1 g/L,硫酸銨2 g/L,KH2PO40.15 g/L,MgSO40.1 g/L,CoCl20.05 g/L,pH7.0。滅菌條件均為:121 ℃滅菌20 min。

LDZX-75KB高壓滅菌鍋 上海申安醫療器械廠;ZF-5手持式紫外燈 南京隆順儀器儀表有限公司;PCR儀 美國Bio-Rad公司;SPX-150B-Z生化培養箱 廣東省醫療器械廠;ZWY-111G恒溫振蕩搖床 上海智城分析儀器制造有限公司;TGL-16B高速離心機 上海安亭科學儀器廠;高效液相色譜儀(high performance liquid chromatography,HPLC)(色譜柱為Waters C18柱(250 mm×4.6 mm,10 μm)) 美國Waters公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 產NHase菌株的分離篩選 稱取采集到的土樣5 g溶于50 mL無菌水中,混勻后靜置沉降,取上清液進行適當稀釋后，涂布于分離培養基平皿上,置于培養箱28 ℃條件下培養3 d,挑選單菌落接入含1 mL基礎發酵培養基的96孔板,28 ℃下220 r/min振蕩培養3 d,加入8 g/L的對羥基苯乙腈并調節pH為7.0轉化30 min,10000 r/min離心5 min,取2 μL上清液點樣于GF254硅膠板,層析展開1 h(正丁醇∶冰乙酸∶水=5∶1∶2),手持式紫外燈254 nm熒光顯色,觀察對羥基苯乙酰胺生成情況并挑選色斑大、顏色深的菌株進行復篩。復篩條件為:500 mL三角瓶裝50 mL基礎發酵培養基、28 ℃、180 r/min搖床振蕩培養72 h,發酵結束后10000 r/min離心5 min取上清液測定酶活力,挑選酶活力高的菌株進行鑒定。

1.2.2 菌株鑒定

1.2.2.1 菌株形態及生理生化鑒定 觀察復篩得到的菌株在分離培養基上的菌落表觀特征,同時對菌體進行革蘭氏染色并觀察。對待測菌株進行糖醇發酵試驗、甲基紅試驗、硝酸鹽還原試驗、丙二酸鹽利用、接觸酶試驗和明膠液化等生理生化指標測定,具體參照《常見細菌鑒定手冊》[22]。

1.2.2.2 分子生物學鑒定 利用細菌基因組提取試劑盒抽提菌株的基因組DNA,以此為模板利用原核生物16S rDNA通用引物進行PCR擴增。引物為27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′),反應體系為25 μL,條件為:預變性94 ℃ 5 min;93 ℃ 45 s,55 ℃ 1 min,72 ℃ 70 s,30個循環;延伸 8 min[23]。PCR產物由上海生工生物工程有限公司測序。測序結果在GenBank數據庫BLAST比對,選取相似性高且是有效發表的菌株序列,運用MEGA 5.0的Neighbor-Joining(NJ)法構建系統發育樹。

1.2.3 酶活力測定 取1 mL,pH7.0、50 mmol/L磷酸鹽緩沖液(含100 mmol/L對羥基苯乙腈),添加適量發酵液,25 ℃反應20 min,立刻加入1 mL三氯乙酸終止反應。10000 r/min離心20 min,HPLC測定對羥基苯乙酰胺含量。液相色譜條件為C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,10 μm),柱溫25 ℃;檢測波長:254 nm;流動相:甲醇∶水∶四氫呋喃∶乙酸(35∶65∶1∶1,v/v),流速:1 mL/min[24]。酶活力定義:在pH7.0、溫度37 ℃的條件下,每1 min轉化生成1 μmol對羥基苯乙酰胺所需的酶量為1個酶活力單位U。

1.2.4 NHase的分離純化 發酵液12000 r/min離心20 min去除菌體,清液為粗酶液;加硫酸銨至飽和度為35%,4 ℃靜置4 h沉淀雜蛋白,高速離心機12000 r/min離心20 min,收集上清液;繼續加入硫酸銨至飽和度為60%,在4 ℃靜置4 h后,12000 r/min離心20 min,棄上清液收集沉淀。用pH7.0的Tris-HCl(0.05 mol/L)緩沖液復溶,透析,再經DEAE-Sepharose離子交換層析、Sefinose TMCL-6B凝膠過濾層析純化后用于酶學性質分析[7]。

1.2.5 酶學性質分析

1.2.5.1 最適溫度及穩定性測定 酶液分別在反應溫度為25～70 ℃(梯度為5 ℃)、pH7.0條件下測定酶活力,以最高酶活力為100%,確定最適溫度。將酶液分別在25～60 ℃(梯度為5 ℃)、pH7.0下處理1 h后冰浴,取樣在最適反應溫度下測定殘余酶活力,以未處理時酶活力為100%,研究酶的熱穩定性。

1.2.5.2 最適pH及穩定性測定 將酶液分別在pH為4.0～9.5(梯度為0.5)的50 mmol/L緩沖溶液配制的催化體系反應,底物濃度為100 mmol/L,在50 ℃條件下反應,設最高酶活力為100%,確定NHase的最適反應pH。將酶液分別在pH為4.0～9.0(梯度為0.5)的緩沖溶液體系中4 ℃處理1 h,取樣在50 ℃、最適反應pH下測定剩余酶活力,以未處理時酶活力為100%,研究NHase的pH穩定性。

1.2.5.3 金屬離子對酶活力影響 在酶反應體系中分別加入1 mmol/L的Fe2+、Cu2+、Mg2+、Co2+、Zn2+、Al3+、Ca2+、Fe3+、Mn2+金屬離子化合物,在50 ℃、pH7.0條件下催化反應,以未加金屬離子的酶反應體系為參照,酶活力設為100%,研究不同金屬離子對NHase活力的影響。

1.2.5.4 米氏常數的測定 將酶液分別與0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8、1.0 mM濃度的對羥基苯乙腈底物溶液在50 ℃、pH7.0條件下反應6 min,通過測定酶活力計算酶的反應初速度,通過米氏方程的雙倒數形式(Lineweaver-Burk plot)計算酶的Km及Vmax。

1.2.5.5 底物特異性測定 分別選100 mmol/L的對羥基苯乙腈、3-氰基吡啶、4-氰基吡啶、苯乙腈、2-氨基丁腈、苯甲腈、苯丙腈為底物與酶反應,測定酶活力,以對羥基苯乙腈為標準對照,酶活力設為100%,研究酶的底物特異性。

2 結果與分析

2.1 產NHase菌株的分離

由圖1可知,以對羥基苯乙腈為誘導物和底物,在分離培養基上稀釋涂布挑選單菌落,接種到96孔板發酵初篩,加對羥基苯乙腈轉化30 min,用TLC法檢測催化產物對羥基苯乙酰胺,通過比移值和產物色度分析,對菌株產生NHase的能力做初步的評判,初篩得到的18株菌株進行搖瓶發酵復篩,培養結束后測定發酵液酶活力，發現菌株Jn-102產酶效果最佳,酶活力達到3.6 U/mL,進一步對該菌株進行種屬鑒定和NHase酶學特性研究。

圖1 菌株Jn-102轉化產物TLC檢測Fig.1 TLC test of transformation products from strain Jn-102注：1:對照;2、3：Jn-102菌株轉化產物。

2.2 菌株Jn-102的鑒定

2.2.1 菌體及菌落形態及生理生化指標鑒定 Jn-102菌株在分離培養基上培養結果如圖2A所示,菌落呈乳白或微黃色、近圓形、培養16 h菌落光滑濕潤、24 h菌落表面干燥有褶皺、邊緣不規則,易挑取;顯微鏡觀察結果如圖2B所示,菌體細胞呈桿狀、多數單個分散存在、個別分裂后不斷裂,革蘭氏陽性,培養72 h后觀察芽孢著生在菌體側端位置,橢圓形或柱形。生理生化檢測結果表明,菌株Jn-102 VP試驗、氧化酶、觸酶、脲酶、酯酶及磷酸酶試驗陽性,甲基紅、吲哚試驗陰性,能同化多數糖醇,不能利用鼠李糖和山梨醇,5% NaCl培養基中生長良好,試驗結果詳見表1。依據《常見細菌系統鑒定手冊》,結合上述試驗結果,將菌株Jn-102初步鑒定為芽孢桿菌屬(Bacillussp.)。

圖2 菌株Jn-10216h和24 h的菌落形態(A)及革蘭氏染色結果(B)(×1000)Fig.2 Colony morphological characteristics(A)and gram staining(B)of strain Jn-102(×1000)

表1 菌株Jn-102的生理生化特征Table 1 Physiological and biochemical characters of bacillus strain Jn-102

2.2.2 菌株分子生物學鑒定 經測序確定菌株Jn-102 16S rDNA序列長度為1382 bp,提交基因序列信息到NCBI GenBank,得到登錄號MF990906,選取與其同源性高且已定名菌株的相關序列信息,用ClustalX 1.83進行序列比對,用MEGA 5.0中的Neighbor-Joining法構建系統發育樹,結果如圖3所示,可以看出菌株Jn-102和Bacillusaryabhattai的遺傳進化距離最近,與已知菌株Bacillusaryabhattai(EF114313)的同源性達到99%以上。結合形態學、生理生化特性指標,鑒定菌株Jn-102為阿氏芽孢桿菌(Bacillusaryabhattai)。

圖3 基于16S rDNA序列的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequences simility of selected strains注：節點數字表示bootstrap支持率,1000次重復。

2.3 NHase的分離純化

BacillusaryabhattaiJn-102 NHase純化結果如表2所示,最終得到NHase的回收率為20.1%,純化倍數為13.9 倍,比活力355.98 U/mg。

表2 Bacillus aryabhattai Jn-102 NHase分離純化結果Table 2 Summary of the purification steps of NHase from Bacillus aryabhattai Jn-102

2.4 酶學特性分析

2.4.1 最適溫度及穩定性測定 由圖4A可以看出,BacillusaryabhattaiJn-102產生的NHase的最適反應溫度為50 ℃,并在35～50 ℃范圍內均具有較高的酶活力,當溫度低于35 ℃時,酶活力隨溫度升高明顯上升,超過50 ℃酶活力迅速降低。該酶的熱穩定性研究表明,溫度低于40 ℃時該酶穩定性良好,保溫1 h仍保留95%以上的活性,溫度超過40 ℃時,酶活性變得不穩定,極易失活(圖4B)。

圖4 溫度對酶活力及酶穩定性的影響Fig.4 Effect of temperature on the activity and stability of nitrile hydratase

2.4.2 最適pH及穩定性測定 測得NHase在不同pH下的酶活力,結果見圖5A,圖中顯示該酶催化反應的pH在6.5～7.5之間活力均較高,其最適反應pH為7.0,當pH在6.5以下或7.5以上時,酶活力下降較快。酶的穩定性驗證如圖5B所示,該酶在pH6.0～8.0的條件下保存1 h后仍保留85%以上的酶活力,可見在此pH范圍內酶穩定性較高,而pH低于或高于此pH范圍時，酶活力均出現較為明顯的降低。

圖5 pH對酶活力及酶穩定性的影響Fig.5 Effect of pH on the activity and stability of nitrile hydratase

2.4.3 金屬離子對酶活力影響 NHase一般為金屬酶,金屬離子和酶活性密切相關。金屬離子對NHase酶活力影響結果如表2所示,Co2+和Mg2+對NHase酶活力有輕微激活作用,但作用不明顯,和對照組相當。而其他金屬離子對酶活均有著不同程度的抑制作用,其中Zn2+的抑制作用最強烈,酶活力剩余68.3%。

表2 金屬離子對卡拉膠酶活性的影響Table 2 Metal ions on nitrile hydratase activity

2.4.4 酶促反應動力學參數的測定 由圖6可知,BacillusaryabhattaiJn-102的NHase水解對羥基苯乙腈符合米氏動力學方程,經計算酶促反應動力學常數Km=21.3 mmol/L,最大反應速率Vmax=60.2 μmol/(min·mg)。Jn-102的NHase對對羥基苯乙腈顯示出較高的親和力,Km低于已有文獻的報道[7-12]。

圖6 雙倒數法測定Bacillus aryabhattai Jn-102的動力學參數Fig.6 Kinetic parameters determination of nitrile hydratase from Bacillus aryabhattai Jn-102 by Lineweaver-Burk plot

2.4.5 底物特異性測定 底物特異性試驗結果如表3所示,NHase對于受試的7種腈類底物均能發生水合作用，形成相應的酰胺化合物,沒有嚴格的底物特異性,尤其對3-氰基吡啶和4-氰基吡啶催化活性較高,相對酶活達到對羥基苯乙腈的200%以上,但對苯甲腈、2-氨基丁腈的活性較低。

表3 菌株Jn-102產腈水合酶的底物特異性Table 3 Substrate specificity of nitrile hydratase from Jn-102

3 結論

本研究自濟寧農田土壤中分離到產NHase活力較高的菌株Jn-102,經分子生物學、生理生化及形態學特征鑒定為阿氏芽孢桿菌(Bacillusaryabhattai)。對其酶學性質進行研究,結果表明酶的最適反應溫度和pH分別為50 ℃和7.0,在40 ℃以下和pH6.0～8.0范圍內酶活力較穩定,具有較寬的底物譜,對芳香腈有較好的水合作用,以對羥基苯乙腈為底物時，Km值和Vmax值分別為21.3 mmol/L和60.2 μmol/(min·mg),Co2+和Mg2+等對酶活力有輕微的促進作用,而Zn2+對酶活力有強烈的抑制作用。這些性質不同于以往報道的NHase,具有良好的開發應用前景,為今后進一步研究NHase在制備酰胺化合物中的應用提供技術支撐和研究基礎。