分子標記輔助聚合基因Pi1和Pi2改良紅色特種秈稻稻瘟病抗性研究

孫富　唐梅　何聰

摘要：紅色特種秈稻是一種極其珍貴的特色稻米資源，稻瘟病是紅色特種秈稻的主要病害，培育抗稻瘟病品種是防治稻瘟病的有效途徑。以含廣譜稻瘟病抗性基因Pi1和Pi2的BL122為供體，紅色特種秈稻桂紅一號為受體，通過雜交、回交和自交并結合分子標記輔助選擇，將Pi1和Pi2基因導入紅色特種秈稻桂紅一號中，獲得了攜帶2個抗性基因的高抗稻瘟病改良材料。對BC3F3代材料進行了苗期和成熟期稻瘟病抗性鑒定，結果表明，攜帶2個抗性基因的目標株系抗性均達到抗以上水平，部分株系達到高抗水平，稻瘟病抗性顯著高于輪回親本。統計分析表明，BC3F3改良材料與對照相比，有效穗數和理論產量顯著增加，而在其他農藝性狀方面無顯著差異。通過分子標記輔助選擇獲得的改良材料為紅色特種秈稻的抗稻瘟病育種創制了新的種質資源。

關鍵詞：紅色特種秈稻；分子標記輔助選擇；稻瘟??；基因聚合；Pi1；Pi2

中圖分類號：S511.2+1；S435.111.4+1 文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2018）18-0023-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.18.005 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Improvement of Rice Blast Resistance in Red Rice by Pyramiding of Pi1 and Pi2 through Molecular Marker-Assisted Selection

SUN Fu，TANG Mei，HE Cong，LU Hong-cong

（Rice Research Institute，Guangxi Academy of Agricultural Sciences/Guangxi Key Laboratory of Rice Genetics and Breeding，Nanning 530007，China）

Abstract： Red rice is an extremely precious characteristic rice resource. Blast is one of the most serious rice diseases worldwide，which usually leads to a sharp decline in rice yield and even results in no yield. Breeding blast-resistant varieties is one of the most effective and economical ways to control the disease. In this study，BL122 containing two blast resistance genes Pi1 and Pi2 was used as gene donor to be crossed and then backcrossed with red rice variety Guihong 1. The improved materials of high resistance to rice blast with two resistance genes were obtained. The resistance identification of rice blast in seedling stage and mature stage of BC3F3 was carried out. The results showed that the resistance of target strains with two resistance genes was all above the resistance level，and some strains reached high resistance level. The resistance of these strains to rice blast was significantly higher than that of the recurrent parent. Statistical analysis showed that，compared with the control，the effective panicle and theoretical yield of BC3F3 were significantly increased， while there was no significant difference in other agronomic traits. The improved materials obtained through molecular marker-assisted selection is a new breeding resource for the breeding of red rice.

Key words： red rice； molecular marker-assisted selection； rice blast； gene pyramiding； Pi1； Pi2

紅色特種秈稻是中國極其珍貴的特色稻米資源，其米飯不但芳香爽口，而且營養比較全面合理，長期以來，作為老弱病孕的營養滋補品，享有“補血米”“藥米”“長壽米”之美稱，是比較理想的保健食品資源之一[1]。與白米相比，紅米含有較多的蛋白質和氨基酸，較多的礦質元素，如鐵、鋅、錳、硒、鈣、鉬、磷及維生素C、維生素B2、維生素B6、維生素B12、胡蘿卜素等，更值得一提的是，紅米中所含的黃酮類化合物比黑米還高[2，3]。紅米成熟以后種皮才變紅，其中的色素又叫濃縮丹寧酸，紅色色素是其營養豐富的原因，也是具有食療價值的原因[3]。紅米具有升高血漿高密度脂蛋白膽固醇和提高機體抗氧化能力的作用，可以減緩或改善動脈粥樣硬化、癌細胞生長、輻射損傷、關節炎等癥狀。在中國，紅色特種秈稻已有數千年的栽培歷史，但目前在生產上應用的紅色特種秈稻品種的稻瘟病抗性弱，給紅米生產帶來嚴重危害，稻瘟病發病嚴重時其植株枯萎死亡，產量大幅下降，嚴重時可達50%。鑒于此，有必要將紅色特種秈稻稻瘟病抗性進行改良，培育出抗性強的新品種。分子標記輔助選擇（Molecular Marker-assisted Selection，MAS）是直接利用與目標基因緊密連鎖的分子標記對其進行選擇，是一種高效的抗病育種方法。研究表明， 持久抗性與多個抗病基因協同作用密切相關。許多具有持久抗性的種質如Moroberekan、Tetep、IR64、三黃占等都具有多個抗病基因[4，5]。多個抗性基因的聚合后，并不簡單地表現為單個抗病基因的抗譜之間的累加，而是抗性基因之間表現為極顯著的基因互作，協同抵抗單個抗病基因不能抵抗的生理小種，這是多基因聚合后抗譜拓寬、抗性增強的重要原因，因此基因聚合是培育稻瘟病持久抗性的有效方法。來源于西非粳稻品種LAC23的Pi1和哥倫比亞秈稻品種“5173”的Pi2基因是兩個顯性廣譜高抗稻瘟病基因[6，7]。Hittalmani等[8]利用分子標記輔助選擇技術將抗稻瘟病基因Pi1、Pi2和Pita聚合到了同一個水稻品系BL124中。陳紅旗等[9]利用分子標記技術聚合Pi1、Pi2和Pi33基因改良金23B的稻瘟病抗性，結果表明，改良后的保持系對稻瘟病的抗病頻率為96.7%，明顯高于僅攜帶單個基因的抗病性。柳武革等[10，11]以含廣譜稻瘟病抗性基因Pi1和Pi2的BL122為供體，溫敏核不育系GD-7S、三系不育系榮豐A為受體，通過雜交、回交和自交并結合分子標記輔助選擇，將Pi1和Pi2基因導入到 GD-7S和榮豐A中，提高了GD-7S和榮豐A的稻瘟病抗性。目前，抗稻瘟病基因多以導入水稻不育系[12]和恢復系[13]當中為主，而將廣譜抗稻瘟病基因Pi1和Pi2基因聚合導入到紅色特種秈稻的研究還未見報道。本研究以高產優質的紅色特種秈稻品種桂紅一號為受體材料，與聚合有抗稻瘟病基因Pi1和Pi2的抗性材料BL122雜交，把Pi1和Pi2導入到其中，以培育出具有高抗稻瘟病的親本材料，為紅色特種秈稻的稻瘟病抗性種質創新，培育出高抗稻瘟病的紅色特種秈稻品種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

含稻瘟病抗性基因Pi1和Pi2的供體親本BL122是由國際水稻研究所育成的多基因累加系，其遺傳背景為秈稻品系CO39，在廣西多年鑒定表現持久高抗稻瘟病特性，種子由廣西作物遺傳改良生物技術重點開放實驗室高利軍副研究員提供，受體親本桂紅一號由廣西農業科學院水稻研究所育成提供。稻瘟病鑒別菌系主要為廣西岑溪市病原菌，由廣西農業科學院植物保護研究所提供。

1.2 抗性基因的分子標記檢測

采集水稻幼嫩葉片用CTAB法快速提取DNA[14]，與稻瘟病抗性基因Pi1和Pi2緊密連鎖的標記M-Pi1（正向引物序列5′-GTGCTGCTGTGGCTAGTTTG -3′，反向引物序列5′-AGTCCCCGCTCAATTTTTCT-3′）和Pi2Dom（正向引物序列5′-TCTCTCTTAGCTGATCCAAGTCA-3′，反向引物序列5′-GCAGGAAT CTCAGATGGTGG-3′）由高利軍副研究員設計開發，引物由深圳華大基因公司合成。PCR反應體系為20 μL的體系，含2.0 μL 10×Buffer，0.4 μL dNTP，正反引物各1.0 μL，0.2 μL Taq酶，2.0 μL模板DNA，13.8 μL ddH2O。PCR反應程序94℃ 5 min，然后35個循環94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，最后72 ℃延伸10 min。擴增產物在1.2%瓊脂糖凝膠中電泳，核酸染料染色后，凝膠成像儀拍照，并記錄結果。

1.3 雜交、回交與選擇方案

桂紅一號×BL122獲得F1，然后以桂紅一號為母本與F1回交獲得BC1F1。為加快改良進程，在此后的回交過程中，通過單株的表現和分子標記檢測結果，在各回交世代中同時攜帶Pi1和Pi2兩個抗性基因，農藝性狀與輪回親本接近的單株進行回交，回交3代后選擇同時攜帶2個目的基因并與輪回親本接近的單株進行自交。整個改良過程包括1次雜交產生F1，3次回交和2次自交，最后獲得抗稻瘟病的BC3F3株系（圖1）。

1.4 稻瘟病抗性鑒定

稻瘟病抗性鑒定分自然病圃鑒定和人工接種鑒定。自然病圃鑒定選擇在稻瘟病重發區廣西金秀縣羅香鄉進行，葉瘟和穗頸瘟按國際水稻研究所的分級標準進行調查；人工接種鑒定在廣西農業科學院水稻研究所的隔離溫室進行，每份材料30株，均設抗感對照，待幼苗長至三葉一心期時，噴霧接種，噴霧量為每100株苗30 mL接種液，24 ℃保濕培養48 h，10～13 d后，采用目測法調查病斑大小。病斑反應型分為9級：0、1、2、3級為R（抗），4、5、6、7、8、9級為S（感）。

2 結果與分析

2.1 利用分子標記輔助選擇聚合Pi1和Pi2基因

以桂紅一號為母本，BL122為父本配制雜交組合，然后以桂紅一號為輪回親本連續回交。從BC1F1世代開始分別利用目標基因Pi1和Pi2緊密連鎖標記M-Pi1、Pi2Dom檢測基因型，選擇標記為有帶型且農藝性狀與輪回親本接近的單株回交。經過連續3次回交獲得BC3F1代后自交，BC3F3分離世代選擇標記為純合抗性基因型且農藝性狀優良的單株。在分蘗盛期，分別利用分子標記檢測對BC1F1群體的105個單株進行分子檢測。Pi1基因的擴增產物大小為460 bp，Pi2基因的擴增產物大小為322 bp。經統計，在BC1F1群體中共檢測到具有460 bp帶型的單株72個，具有322 bp帶型的單株81個。共同具有460 bp帶型和322 bp帶型的單株43個。其他編號的單株中均未同時檢測出460 bp和322 bp帶譜。證明這43個單株即為同時含有Pi1、Pi2基因（純合體）單株。部分PCR擴增結果如圖2、圖3所示。

2.2 稻瘟病抗性表型鑒定

分子標記輔助選擇獲得聚合Pi1和Pi2基因BC3F3改良材料53份。對受體、供體親本及改良株系苗期進行人工接種鑒定進行稻瘟病鑒定。調查結果表明，輪回親本桂紅一號自然狀態下表現感病，抗病級別為9級；供體親本BL122自然狀態下表現抗病，抗病級別為1級；聚合了Pi1和Pi2基因的改良株系抗病效果明顯，抗病級別為1～2級。成熟期在金秀縣羅香鄉調查葉瘟和穗頸瘟發病情況，調查結果表明，輪回親本桂紅一號自然狀態下表現感病，抗病級別為8級，穗頸瘟嚴重；供體親本BL122自然狀態下表現抗病，抗病級別為1級；改良群體自然狀態下抗病級別為1～4級，聚合了Pi1和Pi2基因的43株改良株系抗病級別為1～3級，其中29株表現高抗，抗病級別為1級。

對3份攜帶Pi1和Pi2基因的改良材料進行稻瘟病抗性鑒定，調查材料包含桂紅一號、BL122和桂紅一號/BL122，每份材料調查30株。調查結果發現，桂紅一號表現為高感，抗病級別為8級；BL122表現為高抗，抗病級別為1級；攜帶有抗性基因的改良株系表現為中抗以上水平（表1）。

2.3 主要農藝性狀評價

改良材料主要農藝性狀（表2）與桂紅一號相比，F5世代在株高和穗長等指標與桂紅一號相比有顯著差異，其余世代與桂紅一號無明顯差異；而所有世代在有效穗數指標方面與桂紅一號相比有顯著增加；所有世代在每穗總粒數、結實率、千粒重等指標方面與桂紅一號相比無明顯差異；所有世代在理論產量方面與桂紅一號相比有明顯增加。綜合農藝性狀分析顯示，在導入Pi1和Pi2兩個基因后，其后代的有效穗數和理論產量等農藝性狀指標增加，而對其余農藝經濟性狀指標無顯著影響。

3 討論

采用水稻抗性種質資源或導入抗性基因[8，15]進行水稻抗性育種，是選育抗性水平較高的優質水稻新品種的重要途徑之一。在實際育種中，如何在分離群體的大量個體植株中選擇出目標單株是一項艱巨的工作，利用分子標記輔助的基因聚合方法培育多抗品種已經成為水稻分子育種的重要內容。隨著水稻基因組測序的完成， 越來越多的重要基因被定位或克隆，分子標記輔助的基因聚合育種方法已經成為水稻分子育種的重要手段， 是現代分子生物學與傳統遺傳育種的結合點。在多基因聚合過程中，分子標記輔助選擇具有非常高效的作用， 該技術能夠快速準確地選到聚合2個或2個以上的目標基因的個體，克服了常規表型鑒定的局限性。倪大虎等[15]將抗稻瘟病基因Pi9（t）及抗白葉枯病Xa21和Xa23基因聚合到同一植株中，獲得了4個三基因聚合且農藝性狀優良的株系；陳學偉等[16]利用農藝性狀優良的G46B與地谷、BL-1、Pi4號3個分別含抗病基因Pi-d（t）1、Pi-b、Pi-ta2的稻瘟病材料進行聚合雜交， 并利用分子標記輔助選擇在F2代及BC1代群體獲得了含抗病基因的植株。本研究利用分子輔助標記方法將Pi1和Pi2兩個廣譜抗稻瘟病基因導入桂紅一號中，人工接種鑒定表明改良株系后代抗稻瘟病級別為抗到高抗，自然病圃葉瘟和穗瘟的綜合評價均達到抗和高抗水平。說明多個抗性基因聚合后，并不只是單個抗病基因抗譜之間的簡單累加，而是表現出極顯著的基因互作，使其能夠抵抗單個抗病基因所不能抵抗的多種生理小種。因此聚合了Pi1和Pi2抗性基因的桂紅一號改良材料可能會具有相對穩定的持久抗病特性。

隨著科技發展和人民生活水平的日益提高，人民群眾對稻米品質的要求越來越高，在外觀品質和食味品質之外，更加注重稻米的營養和保健。中醫認為紅米能滋陰腎、健脾開胃，是延緩衰老的保健食品。紅米富含蛋白質、氨基酸、不飽和脂肪酸和人體必需的多種維生素和微量元素。紅米中富含的微量元素鋅、銅、鐵、硒、鉬、鈣、錳等含量比普通稻（白）米高0.5～3.0倍；紅米還含有黃酮類化合物、生物堿、植物淄醇以及強心甙和β-胡蘿卜素等藥用成分。紅米具有升高血漿高密度脂蛋白膽固醇（HDL）和提高機體抗氧化能力的作用[17]。近年來，桂紅一號[18，19]、柳紅占211[20]、柳紅占214[21]等優良紅色特種秈稻品種得到廣西等地廣大農戶和居民的認可，種植面積正在逐步擴大。而在2014年以來， 由于稻瘟病在廣西等地的大范圍爆發，對這些品種的推廣造成嚴重威脅。另一方面，目前在廣西目前還缺乏高產、優質、抗病的優良紅米品種。因此，選育同時具備抗稻瘟病優質紅米品種，既能解決稻瘟病對當前水稻生產的嚴重威脅，又能滿足人們對優質稻米日益增長的消費需求，是廣西現代水稻育種的重要目標。本研究利用分子標記輔助技術將廣譜抗稻瘟病基因Pi1和Pi2導入到桂紅一號中，從而增強其稻瘟病抗性，并利用回交等技術，注重農藝性狀的選擇，使其遺傳背景和農藝性狀與桂紅一號相似，并改良了部分性狀，使其在稻瘟病抗性和農藝性狀方面均有優良的表現，達到了改良桂紅一號稻瘟病抗性的目的。

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