半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis) 2種視黃酸受體RARα和RARγ克隆及組織表達特性*

宋雪松 徐永江 柳學周 史 寶 王 濱 劉永山 張雅星

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半滑舌鰨() 2種視黃酸受體RARα和RARγ克隆及組織表達特性*

宋雪松1,2徐永江1柳學周1①史 寶1王 濱1劉永山1,2張雅星1,2

(1. 青島海洋科學與技術試點國家實驗室海洋漁業科學與食物產出過程功能實驗室 中國水產科學研究院黃海水產研究所 青島 266071；2. 上海海洋大學水產與生命學院 上海 201306)

利用RT-PCR和RACE方法獲得了半滑舌鰨() 2種視黃酸受體RARα和RARγ的cDNA全長序列，并采用定量PCR技術分析了其組織表達特性。半滑舌鰨RARα cDNA序列全長為1823 bp，編碼443個氨基酸；RARγ cDNA序列全長為1959 bp，編碼489個氨基酸。同源性分析顯示，半滑舌鰨RARα和RARγ同源性高達60.8%，與牙鲆()同源性高達97.0%，具有較強的進化保守性。系統進化分析顯示，半滑舌鰨RARα和RARγ分別歸屬于單獨的分支，且與其他魚類聚合成簇。組織表達分析顯示，RARα mRNA在腎中表達量最高，而RARγ mRNA在脾中表達量最高，RARα和RARγ mRNA在其他組織中均有表達，表明半滑舌鰨2種RAR都可能參與多種生理過程調控。半滑舌鰨2種RAR mRNA在有眼側皮膚、無眼側黑化皮膚和無眼側正常皮膚中的表達量依次升高，且發現RARα在正常有眼側皮膚的表達高于RARγ，而RARγ在無眼側正常皮膚中的表達顯著高于RARα，無眼側黑化皮膚中RARα表達高于RARγ。RAR基因在有眼側和無眼側皮膚組織中的差異表達可能和RA/RAR系統調節體色有關。

半滑舌鰨；視黃酸受體；基因克??；表達模式；無眼側黑化

視黃酸(Retinoic acid, RA)是一種脂溶性小分子物質，又稱維甲酸，是維生素A(VA)在機體內經過一系列水解和酶催化作用生成的最終代謝產物。視黃酸合成進入細胞后先與重組人胞內維甲酸結合蛋白-1 (CRABP1)和CRΑBP2蛋白結合，轉運進入細胞核，形成核受體二聚體，調節相關基因的表達(Budhu, 2002)。RA的作用是通過定位在靶細胞核內的特異性受體介導的。目前，已發現兩類視黃酸受體：視黃酸受體(RAR)和視黃酸X受體(RXR)，作為配體激活的轉錄因子(Chambon, 1996)。RAR是一類細胞核受體，屬于類固醇和甲狀腺激素受體超家族，其通過與RXR形成異源二聚體(RAR/RXR)，增加與視黃素應答元件的親和力，由此加強本身的轉錄活性和對配體的敏感性(Kliewer, 1992; Hallenbeck, 1992)。哺乳動物RAR有3種亞型：RARα、RARβ和RARγ，配體為順式視黃酸(9-cis-RA)和反式視黃酸(ATRA)(Brand, 1988)，但魚類中目前沒有發現RARβ亞型的存在(Jones, 1995)。研究發現，RA/RAR系統具有抑制腫瘤生長、保護上皮組織、促進胚胎骨骼心臟功能和視覺發育功能(De Luca, 1991; Zhou, 2017; Isojima, 2014)，并且在抑制細胞凋亡(Herget,1998)和免疫調節(Erkelens, 2017)也有重要生理作用，是機體維持穩態的重要因子。

RA及其受體RAR系統在魚類中的研究較少(Faehnrich, 2016; Zhang, 2013; 冷向軍, 2017)。在鲆鰈類中，RA/RAR系統對牙鲆()骨骼發育和眼睛位移等變態發育過程(Haga, 2002; Martinez, 2007)，對塞內加爾鰨()(Ignacio, 2009)和大西洋庸鰈()(Lewis-McCrea, 2010)骨骼發育畸形都具有重要的生理調控作用。對牙鲆的研究表明，利用9-cis-RA或者ATRA處理變態前仔魚，可以通過RA/RAR信號通路的介導作用抑制魚苗眼睛完成位移。同時發現，牙鲆和半滑舌鰨()皮膚的RA濃度在有眼側皮膚高于無眼側皮膚，且光照可通過RA/RAR信號通路誘導牙鲆無眼側色素過度沉著(黑化)，表明RA/RAR信號通路在半滑舌鰨、牙鲆的體色左右不對稱發育模式中起重要調控功能(Shao, 2017)，但RA/RAR系統對半滑舌鰨體色調控的具體機制仍待進一步研究。

半滑舌鰨屬鰈形目、舌鰨科、舌鰨屬，為我國近海自然分布的重要經濟魚類，自人工繁育技術取得突破以來，其養殖產業得到快速發展，已成為鲆鰈類三大主導養殖品種之一(鄧景耀等, 1988; 柳學周等, 2006、2014)。養殖生產中發現，半滑舌鰨無眼側黑化(色素沉積過多)問題日益凸顯，而無眼側發生黑化的商品魚市場價格較無眼側正常魚價格低20%以上，成為制約半滑舌鰨養殖產業經濟效益的瓶頸之一。目前，國內外對半滑舌鰨無眼側黑化發生的相關機制鮮有報道，本實驗室前期研究了半滑舌鰨體色相關功能基因POMC、MCHR與MCH等的克隆、表達調控及其與體色的關系(史學營等, 2015、2017; 朱學武等, 2016; 徐永江等, 2017)，為認識半滑舌鰨無眼側體色調控機制積累了資料。本研究擬開展半滑舌鰨RAR結構及其表達特性研究，以期為探究RA/RAR系統在養殖半滑舌鰨無眼側黑化調控中的作用機制提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 實驗用魚及樣品處理

實驗用半滑舌鰨于2017年6~8月取自山東省海陽市黃海水產有限公司。取樣實驗魚3尾(都存在一定程度無眼側黑化)，體長為(33±3) cm，體重為(237±30) g，用于RAR基因克隆與組織表達特性分析。實驗魚以MS-222 (280 mg/L)麻醉后，快速取性腺、肝臟、心臟、胃、腸、脾、腎、垂體、腦、鰓、肌肉、有眼側正常皮膚、無眼側黑化皮膚和無眼側正常皮膚組織投入液氮速凍后，轉入–80℃保存，用于總RNA的提取。

1.2 總RNA提取和cDNA第1鏈合成

利用RNAiso Plus (TaKaRa，日本)試劑盒并按照操作說明提取各組織樣品總RNA，通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質量，NanoDrop 2000 (Thermo，美國)測定RNA濃度。取適量鰓組織總RNA，以PrimeScriptTMⅡ1st strand cDNA Synthesis Kit (TaKaRa，日本)合成cDNA第1鏈。以SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit(Clontech，美國)合成5￠-RACE及3￠-RACE cDNA第1鏈，用于RAR基因RACE全長克隆。取等量各組織樣品的總RNA，用PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser反轉錄試劑盒(TaKaRa，日本)合成cDNA第1鏈，用于RAR mRNA組織表達特性及分析。各操作步驟均嚴格按照使用說明書進行。

1.3 總RNA提取和中間片段擴增

根據GenBank登記的XM_017034299.1、XM_ 008318896.2預測半滑舌鰨RARs序列保守區設計特異引物(表1)，以肝臟組織為模板，擴增RARα基因的核心序列，PCR反應體系(25 μl)：0.2 μl酶、2.5 μl 10×PCR Buffer、2 μl dNTP Mixture、0.5 μl模板、1 μl RARα-F、1 μl RARα-R、17.8 μl ddH2O。反應條件：94℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 2 min，38個循環；72℃延伸10 min。擴增RARγ基因的模板為脾臟，PCR反應體系和條件同RARα；PCR產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳分離后，切膠回收目的條帶并純化?；厥誔CR產物與pEASY-T1載體(北京全式金生物公司)連接，轉化至Trans1-T1感受態細胞(全式金)，LB固體培養基37℃培養過夜，挑取陽性克隆送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序；RAR的中間序列已上傳NCBI數據庫(RARα登錄號：MG596268；RARγ登錄號：MG596269)。

表1 半滑舌鰨RAR基因克隆使用的PCR擴增引物

Tab.1 Primers used for PCR amplification of RAR of C. semilaevis

1.4 RAR的RACE擴增

根據克隆驗證的中心片段設計RACE引物。用Smart RACE Advantage 2 PCR試劑盒(Clontech，美國)進行梯度PCR擴增。第1次PCR，反應體系：17 μl ddH2O、2.5 μl Buffer、2 μl 50×dNTP Mix、0.5 μl 50×Advantage 2 Polymerase Mix、1 μl cDNA、引物RARα1 1 μl和1 μl UPM，共計25 μl。設計Touchdown PCR，反應條件為94℃ 30 s，66℃30 s，72℃ 2 min，15個循環，T值每5個循環降低2℃；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 2 min，20個循環；最后72℃延伸5 min。以第1次PCR產物稀釋10倍為模板，進行巢式PCR，反應體系：17 μl ddH2O、2.5 μl Buffer、2 μl 50×dNTP Mix、0.5 μl 50×Advantage 2 Polymerase Mix、1 μl cDNA、1 μl NPM和1 μl RARα2引物，共計25 μl。PCR反應條件同第1次PCR。PCR產物于1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，對目的條帶進行膠回收、載體連接、轉化、篩選陽性克隆并測序。RARγ反應體系與條件同RARα。

1.5 RAR mRNA定量表達分析

根據獲得的半滑舌鰨RARα和RARγ的cDNA序列設計定量PCR引物qRARα和qRARγ(表1)，以18S為內參。利用Mastercycler ep realplexreal-time PCR儀(Eppendorf，德國)，使用SYBR Premix ExTMⅡ試劑盒(TaKaRa)進行定量擴增，PCR體系(20 μl)：1 μl cDNA模板、上下游引物各0.8μl (10 μmol/L)、10μl SYBR Premix ExTMⅡ和7.4 μl dd H2O.。PCR反應條件：95℃預變性30 s，95℃5 s，58℃20 s、共40個循環。每個樣品測試設置3個重復。RAR mRNA的表達量以18S mRNA表達量為基礎，利用2-DD方法計算獲得(Livak, 2001)。

1.6 序列分析及數據處理

半滑舌鰨RAR基因的結構、分子量預測、等電點預測使用ExPASy在線數據庫預測(www.expasy. org/tools/protparam.html)；氨基酸序列推導、序列拼接和氨基酸同源性分析均使用軟件DNAMAN 6.0，信號肽預測使用SignalP 4.1 (http://www.cbs.dtu.dk/ services/SignalP/)。亞細胞定位使用PSORT Ⅱ軟件(https://psort.hgc.jp/form2.html)。結構域預測使用NCBI數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/ cdd/wrpsb.cgi)，氨基酸序列比對和系統進化分析使用ClustalW在線軟件(http://www.genome.jp/tools-bin/ clustalw)和MEGA 7軟件。通過SOPMA軟件(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)分析蛋白質二級結構，通過SWISS-MODEL在線軟件(http://www.swi-ssmodel.expasy.org/)分析預測蛋白質三級結構。

實驗數據均以平均值±標準差(Mean±SD)表示，多組數據間比較采用SPSS 19.0統計軟件進行單因素方差分析(One-way ANOVA)、Duncan和SNK多重比較分析，當<0.05時表示差異顯著。

2 結果

2.1 RAR cDNA序列結構

半滑舌鰨RARα cDNA序列全長為1823 bp (圖1)，包括17 bp的5￠非編碼區(UTR)、1332 bp的開放閱讀框(ORF)和474 bp的3￠非編碼區(UTR)，編碼443個氨基酸，預測編碼蛋白分子量為49 kb，等電點為8.47。半滑舌鰨RARγ cDNA序列全長為1959 bp (圖2)，包括305 bp的5￠(UTR)、1497 bp的ORF和98 bp的3￠(UTR)，編碼498個氨基酸，預測編碼蛋白的分子量為55.8 kb，等電點為4.99。預測2種RAR基因的亞細胞定位均位于細胞核。

2.2 RAR編碼蛋白質空間結構預測

通過SOPMA軟件分析RAR編碼蛋白的空間二級結構：在RARα成熟蛋白的二級結構中，α-螺旋占34.31%，β-轉角占8.35%，無規則卷曲占43.12%，延伸鏈占14.22%。在RARγ成熟蛋白的二級結構中，α-螺旋占36.75%，β-轉角占9.44%，無規則卷曲占40.36%，延伸鏈占13.45%。通過SWISS-MODEL網站同源建模方法構建了半滑舌鰨RAR編碼的蛋白質可能的三級結構，以同源建模的方法與各自的50個RA核受體家族模板構建預測可能的蛋白質三級結構，RARα獲得6種三級結構模型，選取GMQE評價值0.55、QMEAN穩定系數-2.79(負值越大越穩定)構建模型；RARγ有5種，選取GMQE評價值0.61，QMEAN穩定系數-2.13構建模型。三級結構模型顯示(圖3)，RAR蛋白質分為3部分，藍色的DBD區和LBD區通過橘黃色的D區鉸鏈區相連。

2.3 RAR的氨基酸序列同源性比較

同源性分析顯示，半滑舌鰨RARα的氨基酸序列與同屬鰈形目的牙鲆的同源性最高，為97.0%，其次為銀大麻哈魚()92.2%、鱸魚() 87.9%、斑馬魚()86.8%、紅鰭東方鲀()64.6%，且與兩棲類、爬行類、嚙齒類、鳥類和人()的相似度分別為79.6%、82.2%、80.5%、81.5%和80.7%。半滑舌鰨RARγ的氨基酸序列同樣與牙鲆同源性最高，達97%，與其他魚類的同源性均達90.5%以上，與兩棲類、嚙齒類和人的相似度分別為71.4%、84.5%和80.7%。另外，半滑舌鰨RARα和RARγ的氨基酸序列相似度為60.8% (表2)。

通過結構域預測發現，半滑舌鰨與鱸魚、人、斑馬魚具有相似的功能結構域，都具有DNA結合區(DBD區)和配體結合區(LBD)區。利用ClustalW對半滑舌鰨RAR的氨基酸序列與其他物種的RAR氨基酸序列進行了比較(圖4)。結果發現，半滑舌鰨與其他魚類RAR的氨基酸序列整體保守性較強，除在N端的A/B區和C端的F區末尾保守型較差外，中間的DNA與配體結合區保守度較高。

2.4 RARs系統進化分析

利用NJ法構建了基于氨基酸序列的半滑舌鰨RARα、RARγ和其他脊椎動物的系統進化樹(圖5)，半滑舌鰨RARα和RARγ都分別與鰈形目、鱸形目、鯉形目等其他魚類形成獨立的分支，而兩棲類、哺乳類和爬行類形成獨立的分支。

2.5 RARmRNA的組織表達特性

半滑舌鰨2種RAR基因在所有檢測組織中都有表達。RARα mRNA在腎臟和眼中表達量最高，與除胃的其他組織差異顯著，在胃中的表達也較高，在腦、脾臟、鰓、無眼側白皮膚、性腺、有眼側肌肉、腸、心臟、無眼側黑化皮膚、無眼側肌肉、有眼側皮膚等其他組織中也檢測到一定的表達量。半滑舌鰨RARγmRNA在脾臟和鰓中表達量最高，在心臟和腎臟表達量也較高，與其他組織差異顯著；而在無眼側白皮膚、腦、眼、胃、性腺、無眼側黑化皮膚、無眼側肌肉、垂體等其他組織表達量相對較低。在腎臟中，2種RAR mRNA表達水平都很高。脾臟、心臟、鰓、腎臟、無眼側白皮膚等組織中RARγmRNA表達量高于RARα，而在眼、胃、腸、性腺、肌肉、肝臟、有眼側皮膚、無眼側黑化皮膚等組織中，RARα mRNA表達量高于RARγ，脾臟、心臟、鰓和腎臟組織中RARγ與RARα表達差異顯著，而其他組織中RARγ與RARα表達差異不顯著。腦中2種RAR mRNA表達量基本一致，表明這2種RAR基因在不同組織中的生理功能可能存在差異，即使在同一組織中其生理功能也多存在一定的差異(圖6)。

圖1 半滑舌鰨RARα基因cDNA全長序列及推導的氨基酸序列

推導的氨基酸序列用單字母表示，從陰影顯示的起始甲硫氨酸開始計數。終止密碼子用*表示。下同

The deduced amino acid residues were represented as single letter abbreviations and numbered from the initiating methionine which was shadowed. Termination codon was marked with *. The same as below

圖2 半滑舌鰨RARγ基因cDNA全長序列及推導的氨基酸序列

圖3 SWISS-MODEL預測的半滑舌鰨RARα(左)和RARγ(右)蛋白質三級結構

分析有眼側皮膚、無眼側黑化皮膚和無眼側白皮膚中2種RAR基因mRNA的表達情況(圖7)，發現無眼側白皮膚的2種RAR mRNA的表達量最高，其次為無眼側黑化皮膚，最低的為有眼側皮膚，其中，RARγ表達差異顯著。RARγ在無眼側未黑化皮膚中的表達顯著高于RARα (<0.05)，而在正常有眼側皮膚和無眼側黑化皮膚中，RARα的表達高于RARγ，表明可能RARα和RARγ對皮膚組織中色素的調控作用具有不同的調控機制。

3 討論

本研究獲得了半滑舌鰨RAR的2個亞型RARα和RARγcDNA序列全長，并研究了其組織表達特性，為研究RA/RAR系統對體色異常調控提供了基礎材料。本研究獲得了半滑舌鰨2個RAR亞型的結構，預測未發現跨膜結構和信號肽(Napoli, 1996)。同其他脊椎動物一致，半滑舌鰨RAR具備A~F共6個功能域，在進化過程中高度保守，其中，C區最為保守，具有鋅指結構功能的為DBD區。E區在配體結合中起輔助作用，形成疏水氨基酸殘基。D區作為鉸鏈連接DBD和LBD (Leid, 1992)。同源性分析表明，半滑舌鰨RARα和RARγ的氨基酸序列與牙鲆的同源性最高，達97%，與其他魚類、兩棲類、爬行類、嚙齒類和人的氨基酸同源性也處于較高水平，表明其在進化過程中保守性較強。同時，本研究顯示，半滑舌鰨RARα和RARγ的氨基酸同源性達60.8%，但在進化樹上屬于2個不同的進化分支，表明在進化過程中2種RAR受體基因出現了進化差異。

表2 半滑舌鰨RAR氨基酸序列與其他脊椎動物的同源性比較

Tab.2 Comparison of homology of the precursor peptide sequences of RAR gene between C. semilaevis and other vertebrates

圖4 半滑舌鰨與其他物種的RAR氨基酸序列比較

“*”表示一致的氨基酸；“:”表示高度保守度的氨基酸；“.”表示低保守度的氨基酸；陰影部分表示DBD和 LBD功能結構域；RAR氨基酸序列號見表2；CS：半滑舌鰨；DR：斑馬魚LJ：鱸魚；HS：人

Asterisks (*) indicated identical amino acid sequences; Dot (:) indicated highly conserved amino acid sequences; Dot (.) indicatedamino acid sequences of low degree conserved; GenBank accession numbers were shown in Tab.2. The shadow part represents the DBD and LBD functional domains CS:;DR:; LJ:;HS:

圖5 基于RAR氨基酸序列的NJ系統進化樹

圖6 半滑舌鰨RAR mRNA在不同組織中的相對表達量

BR：腦；EYE：眼；GI：鰓；H：心臟；L：肝臟；SP：脾臟；K：腎臟；ST：胃；I：腸；GO：性腺；EM：有眼側肌肉；BM：無眼側肌肉；ES：有眼側皮膚；BHS：無眼側黑化皮膚；BWS：無眼側白皮膚；P：垂體。不同組織表達差異分析中Y和y字母代表單獨分析RARγ的2個顯著差異集合，RARα單獨分析使用a、b、c，代表3個顯著差異集合，同一組織2種基因表達顯著差異(<0.05)用大括號表示，下同

B: Brain; EYE: Eye; GI: Gill; H: Heart; L: Liver; SP: Spleen; K: Kindey; ST: Stomach; I: Intestine; GO: Gonad; EM: Eye-side muscle; BM: Blind-side muscle; ES: Eye-side skin; BHS: Blind-side hypermelanosis skin; BWS: Blind-side white skin; P: Pituitary. In different tissue expression analysis, Y and y letters represent two distinct different sets of RARγ analysis separately, RARα analysis alone, a, b and c represent three significant different sets. The significant difference in the expression of two genes in the same tissue is expressed in braces (<0.05), the same as below

圖7 半滑舌鰨RAR mRNA在皮膚組織中的相對表達量

ES：有眼側皮膚；BHS：無眼側黑化皮膚；BWS：無眼側白皮膚

ES: Eye-side skin; BHS: Blind-side hypermelanosis skin; BWS: Blind-side white skin

本研究發現，半滑舌鰨2種RAR基因mRNA在所有檢測組織中均有表達，表明其均具有廣泛的生理作用。RARα mRNA在腎臟中表達量最高，表明腎臟可能為其主要靶器官，而同時在眼、腦和胃中的表達量高于其他組織，表明RARα在這些組織器官的生理功能中都可能起重要的調控作用，這種組織表達分布特征與斑馬魚(Joore, 1994)、鱸魚(錢云霞等, 2012)以及哺乳動物(Meng, 2011) RARα的組織表達特性相似。另外，半滑舌鰨RARγmRNA的主要靶器官為脾臟和鰓，同時，在心臟和腎臟中均有高表達量，表明RARγ主要在這些器官中起重要的表達調控作用。2種RAR受體mRNA都在腎臟中具有高表達，推測腎臟可能是RA/RAR信號通路的重要作用靶點，具體作用方式有待于下一步深入研究。對虹鱒()的研究結果表明，鰓是RAR的主要表達器官，推測與其較高的新陳代謝速率有關，也可能與RAR調節細胞生長與凋亡功能相關(Alsop, 2001)。本研究也發現，鰓中2種RAR受體基因的表達量較高，但其具體的生理功能有待于進一步研究。在對雞()的RARγ研究中，發現雞與哺乳動物有相似的表達特異性，即RARγ表達高度限制在皮膚中(Michaille, 1994)，然而，半滑舌鰨RAR表達在皮膚和肌肉相對其他組織較少，這種組織分布的差異主要可能是由種的差異引起的。

本研究中，比較了有眼側皮膚、無眼側白皮膚和無眼側黑化皮膚中2種RAR基因mRNA的表達情況和兩者的相互關系，發現在正常有眼側皮膚中和在無眼側黑化皮膚中RARα的表達略高于RARγ，而在無眼側未發生黑化的皮膚中，RARγ的表達卻顯著高于RARα。先前對半滑舌鰨色素細胞的研究表明，黑色素與虹彩細胞等的數量分布以有眼側皮膚中最多，無眼側黑化皮膚中其次，而無眼側白皮膚中無黑色素細胞分布(史學營等, 2015)。這種不同狀態的皮膚組織中RAR轉錄產物表達與黑色素細胞分布的關系表明，RARγ與RARα均參與了半滑舌鰨皮膚組織中黑色素細胞的生長發育與分布調控過程，但其在皮膚組織中黑色素細胞的形成方面具有差異表達調控作用。與RARγ相比，RARα與皮膚中黑色素細胞的生長及數量分布調控可能具有更為密切的關系。今后應結合鲆鰈類黑色素相關基因(如MCH、MCHR、POMC等)的表達和作用機理進行深入研究，探討它們之間的相互作用關系。

在牙鲆研究中，RARs與配體ATRA結合作用于苗種骨骼變態和體色沉著(Haga, 2003)。Shao等(2017)通過轉錄組研究發現，牙鲆和半滑舌鰨有眼側皮膚ATRA和9-cis-RA濃度均高于無眼側皮膚，但兩側皮膚中RAR和RXR的基因表達沒有明顯差異。本研究未能測定不同類型皮膚中的RAR配體濃度，是否是配體濃度梯度的差異導致受體基因表達量的差異有待于今后深入研究。結合本研究RAR在皮膚中的分布，推測半滑舌鰨RAR可能與黑色素細胞的發育及分布具有不同的關系。已有研究證明，在斑馬魚中存在RARα-a和RARα-b亞型(Hale, 1993)，而半滑舌鰨基因組預測其具有RARα、RARβ和RARγ三種亞型，同時，每一種亞型又有數種不同的分子形式(Chen, 2014)，開展RAR基因在不同組織器官中的表達特征和可能的生理功能研究有助于闡明RA/RAR系統在無眼側黑化發生的機理。本研究中，還發現半滑舌鰨RARα和RARγ mRNA在腎臟、脾臟、腦、眼、胃、無眼側白皮膚、性腺等組織中同時具有高表達，且在不同的組織中2種受體基因表達量不同，表明半滑舌鰨2種RAR基因在不同的組織中生理功能不同。Shao等(2017)在成年牙鲆兩側皮膚中發現，感光視蛋白對光照刺激有應答反應，在光刺激下會影響配體RA在體兩側的濃度差，作用于RA/RAR系統導致無眼側發生黑化。工廠化養殖環境中發現，幼魚通過補充RAR的配體RA控制了鲆鰈類有眼側無黑色素沉著現象(白化)，而過量的RA補充卻會導致無眼側黑色素沉著過多(黑化)(Miwa, 1999)。研究發現，改變光照(Shao, 2017)、鋪沙(Estevez, 2001)、棲息環境顏色(Takahashi, 2004)和養殖密度(Bolker, 2000)等也會影響無眼側黑色素沉著，且這些外源刺激都與攝食RA或通過眼和皮膚的感光視蛋白接收刺激產生RA，從而調控RAR表達，并最終作用于鲆鰈類的體色沉著有一定關系。Isojima等(2014)研究表明，鲆鰈類體色發生與分布受到多種基因表達調控。深入開展RA/RAR系統對體色的調控作用及其信號通路的系統研究將有助于揭示半滑舌鰨無眼側黑化的分子調控機制。

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Molecular Cloning and Spatial Expression of Two Retinoic Acid Receptors RARalpha and RARgammafrom

SONG Xuesong1,2, XU Yongjiang1, LIU Xuezhou1①, SHI Bao1, WANG Bin1, LIU Yongshan1,2, ZHANG Yaxing1,2

(1. Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao), Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071; 2. College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306)

Two retinoic acid receptors, RARalpha and RARgamma, were cloned fromusing RT-PCR and RACE methods, and their spatial expression patterns were investigated using a quantitative PCR assay. The results showed thatfull-length cDNA sequence encoding the RARalpha gene is 1823 bp in length, its open reading frame (ORF) length is 1332 bp, encoding 443 amino acids; the RARgamma cDNA sequence is 1959 bp in length, and the length of ORF is 1497 bp, encoding 489 amino acids. Homology analysis showed thatRARalpha and RARgamma have homology identity of 60.8%, and both have 97% homology identity with the Japanese flounder. Phylogenetic analysis showed thatRARalpha and RARgamma clustered into a separate branch with other fish counterparts. Spatial expression analysis showed that the highest expression level of RARalpha mRNA occurred in the kidney, whereas the highest expression level of RARgamma mRNA was in the spleen. RARgamma was also highly expressed in the gill, kidney, and heart. Furthermore, RARalpha and RARgamma mRNA expression were detected in all examined tissues, which indicated that these two retinoic acid receptors were both involved in multiple physiological regulation processes. In addition, the differential expression of these two RAR genes were found in the blind side and ocular skins, wherein they both had highest expression levels in the normal blind side skin, followed by the blacking blind side skin and had the lowest expression levels in the ocular side skin. In ocular skin and blind-side blacking skin, the RARalpha expression levels were higher than RARgamma but without significant difference, wherein in blind-side normal skin, the RARgamma expressed significantly higher than RARalpha. This differential expression pattern indicated that they might play important physiological roles in blind-side hypermelanosis regulation of.

; Retinoic acid receptor; Gene cloning; Expression pattern; Hyperpigmentation

LIU Xuezhou, E-mail: liuxz@ysfri.ac.cn

宋雪松, 徐永江, 柳學周, 史寶, 王濱, 劉永山, 張雅星. 半滑舌鰨() 2種視黃酸受體RARα和RARγ克隆及組織表達特性. 漁業科學進展, 2018, 39(6): 52–64

Song XS, Xu YJ, Liu XZ, Shi B, Wang B, Liu YS, Zhang YX. Molecular cloning and spatial expression of two retinoic acid receptors RARalpha and RARgammafrom. Progress in Fishery Sciences, 2018, 39(6): 52–64

* 中國水產科學研究院中央級公益性科研院所基本科研業務費專項資金(2017GH05; 2017GH17)、國家海水魚產業技術體系(CARS-47)、國家自然科學基金(31502145; 31602133)、中國水產科學研究院黃海水產研究所基本科研業務費項目(20603022017016)共同資助 [This work was supported by Central Public-Interest Scientific Institution Basal Research Fund, Chinese Academy of Fishery Sciences (CAFS) (2017GH05; 2017GH17), China Agricultural Research System (CARS-47), National Natural Science Foundation of China (31502145; 31602133), and Central Public-interest Scientific Institution Basal Research Fund, YSFRI, CAFS (20603022017016)]. 宋雪松，E-mail: 746284973@qq.com

柳學周，研究員，E-mail: liuxz@ysfri.ac.cn

2017-12-20,

2018-01-29

10.19663/j.issn2095-9869.20171220003

TS201.4；S917.4

A

2095-9869(2018)06-0052-13

(編輯 馮小花)