可逆加成-斷裂鏈轉移沉淀法制備對羥基苯甲酸丁酯分子印跡聚合物及其應用

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(1.齊齊哈爾大學化學與化學工程學院，黑龍江齊齊哈爾 161006；2.黑龍江肇東市第二中學，黑龍江綏化 151100)

對羥基苯甲酸酯類化合物(Parabens)亦稱尼泊金酯[1]，通常包括對羥基苯甲酸甲酯(MP)、對羥基苯甲酸乙酯(EP)、對羥基苯甲酸丙酯(PP)和對羥基苯甲酸丁酯(BP)。該類化合物由于其化學穩定性好、抗菌活性強、pH應用范圍廣等優點，在食品、化妝品及醫藥等行業用作防腐劑。但對羥基苯甲酸酯類化合物具有弱雌激素活性作用[2]，長期使用危害人體健康。中國化妝品衛生規范(2007版)[3]中規定：單一對羥基苯甲酸酯的質量分數不應超過0.4%，混合酯的總量不可超過0.8%。因此，對化妝品中對羥基苯甲酸酯類化合物的靈敏、準確檢測尤為重要。

化妝品中成分復雜，其前處理手段[4]如液液萃取、固相萃取和固相微萃取等選擇性較低。將分子印跡聚合物(MIPs)與固相萃取相結合，可選擇性富集對羥基苯甲酸酯，但目前多數研究僅限于對一種對羥基苯甲酸酯富集[5 - 7]，限制了其在實際樣品中的應用。因此，建立一種同時富集與檢測化妝品中對羥基苯甲酸酯的方法具有重要意義。本文采用分子印跡技術，以對羥基苯甲酸丁酯為模板分子，采用可逆加成-斷裂鏈轉移(RAFT)自由基聚合[8 - 9]與沉淀聚合相結合，制備了分子量分布窄、粒徑均一，并且對對羥基苯甲酸酯類化合物具有組選擇性的MIPR微球，將該微球用作固相萃取材料，結合高效液相色譜分析，測定化妝品中對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯和對羥基苯甲酸丁酯的含量。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

ACQUITY高效液相色譜儀(Waters科技有限公司)；TΜ-1901型紫外-可見分光光度計(北京普析通用儀器有限公司)；S-4300型掃描電子顯微鏡(日本，Hitachi公司)。

對羥基苯甲酸酯類化合物(MP、EP、PP、BP)、檸檬酸(CA)、苯甲酸(BA)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；α-甲基丙烯酸(MAA)、丙烯酰胺(AM)，天津市科密歐化學試劑中心；乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)，東京化成工業株式會社；氯化芐，Sigma試劑有限公司；偶氮二異丁腈(AIBN)，北京化工廠。以上試劑均為分析純。甲醇、乙腈為色譜純，天津市科密歐化學試劑中心。實驗用水為蒸餾水。

1.2 可逆加成-斷裂鏈轉移(RAFT)沉淀聚合法制備分子印跡聚合物

1.2.1RAFT試劑二芐基三硫代酯的制備參考文獻方法[10]，采用相轉移催化法制備二芐基三硫代酯(DBTTC)。

1.2.2分子印跡聚合物的制備準確稱取模板分子BP 0.0971 g(0.5 mmol)與功能單體AM 0.1422 g(2 mmol)加入到20 mL乙腈中，超聲30 min使其均勻分散，室溫下預組裝12 h；加入1.19 g(6 mmoL)交聯劑EDMA、0.03 g引發劑AIBN和RAFT鏈轉移試劑(DBTTC)0.1 g，超聲溶解后，充氮除氧，置于60 ℃ 水浴鍋中聚合24 h，真空抽濾獲得聚合物；用甲醇∶乙酸(9∶1，V/V)溶液洗至無BP檢出，用甲醇抽濾，洗去過量乙酸，真空干燥，得到分子印跡聚合物(MIPR)。非印跡聚合物(NIPR)除不加模板分子外，步驟同上。按上述步驟不加RAFT試劑，制備傳統印跡聚合物(MIPT)與傳統非印跡聚合物(NIPT)。

1.3 分子印跡聚合物吸附性評價

1.3.1靜態等溫吸附實驗配制不同濃度梯度BP溶液(0.02～0.2 mg/mL)，分別加入10 mg聚合物，超聲30 min后室溫靜置24 h。取上清液1 mL，0.45 μm膜過濾，高效液相色譜法(HPLC)檢測。

1.3.2選擇性吸附實驗稱取5份各20 mg的MIPR與NIPR，分別加入到1.0 mg/mL的MP、EP、PP、CA、BA溶液中，靜置24 h，取上清液1 mL，0.45 μm膜過濾后，HPLC法檢測。

1.4 實際樣品分析

1.4.1固相萃取柱的制備稱取50 mg MIPR，裝填于3 mL帶有濾板的聚丙烯空柱中，制成分子印跡固相萃取(MISPE)小柱。

1.4.2化妝品樣品的處理及回收率測定稱取5.0 g市售的BB霜樣品，加入30 mL乙醇，超聲溶解30 min 后，過濾，取3 mL濾液，上樣于甲醇活化后的MISPE中，萃取后用5 mL蒸餾水淋洗，10 mL甲醇-乙酸(9∶1，V/V)洗脫，將洗脫液N2吹干，1 mL流動相定容，0.45 μm膜過濾，HPLC法檢測。

1.4.3HPLC分析條件色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18柱(100×2.1 mm，1.7 μm)，流速0.5 mL/min；流動相為乙腈；紫外檢測波長254 nm。

2 結果與討論

2.1 分子印跡聚合物形貌表征

采用掃描電子顯微鏡(SEM)對MIPT及MIPR的形貌進行表征。如圖1所示，傳統沉淀法制得的MIPT粒徑大小不一，且有粘連，RAFT法制得的MIPR外貌呈均勻球形，粒徑(約為4 μm)明顯增大，且微球之間沒有粘連，更適合用于固相萃取填料。這歸功于RAFT試劑在制備微球聚合反應中的調控作用。

圖1 聚合物掃描電鏡(SEM)圖 Fig.1 SEM images of MIPT and MIPR a.MIPT;b.MIPR.

2.2 分子印跡聚合物吸附性評價

2.2.1靜態等溫吸附采用靜態等溫吸附實驗[12]得到4種聚合物在0.02～0.2 mg/mL線性范圍內的吸附等溫線。如圖2所示，聚合物的吸附容量Q隨著BP濃度的增加而增加；當BP的濃度高于0.16 mg/mL時，吸附趨于平衡，表明聚合物上的活性結合位點達到吸附飽和。MIPR和MIPT的吸附容量(41.8 mg/g，33.5 mg/g)大于NIPR和NIPT的吸附容量(13.7 mg/g，15.7 mg/g)，這是由于分子印跡聚合物中含有與BP相匹配的印跡孔穴與相應的結合位點，特異性吸附作用使吸附容量較大，而非分子印跡聚合物對模板分子的吸附沒有特異性，吸附容量較小。同時，MIPR的吸附容量高于MIPT，這是由于RAFT試劑的加入使聚合物微球粒徑分布均勻，內部孔穴更加均勻所致，結合位點增多，吸附容量較高。相反，NIPR的吸附容量低于NIPT，這是由于RAFT試劑的引入，增大聚合物的粒徑，降低聚合物微球的比表面積，所以NIPR吸附容量較NIPT小。

在分子印跡中，常用Scatchard模型[13 - 14]評價MIPs的結合特性，Scatchard曲線如圖3所示。圖中有兩條線性相關的直線，擬合方程和相關系數分別為：y=-26.0x+719.6，R2=0.9993和y=-3.2x+431.4，R2=0.9714。說明在所研究的濃度范圍內，MIPR與BP之間存在高、低兩種結合位點。結合其結構分析，其作用力一種是酸堿作用，另一種是氫鍵作用。

圖2 MIPR、MIPT、NIPR和NIPT的吸附等溫線Fig.2 Adsorption isotherm of MIPR，MIPT，NIPR and NIPT

圖3 Scathard分析曲線Fig.3 Scatchard analysis plot

分別用Langmuir、Freundlich吸附等溫線模型[15]對吸附平衡數據進行擬合。如果符合Langmuir吸附等溫模型，則表示聚合物表面是均勻的，只覆蓋一種吸附位點，是單分子層吸附。如果符合Freundlich吸附等溫模型，則聚合物對模板分子的吸附是多分子層的，且是非均一的。MIPR對BP的兩種吸附等溫線模型參數見表1，通過比較R2可以看出，印跡聚合物吸附行為與Freundlich模型更加吻合。這表明印跡聚合物的吸附過程是多層吸附，與Scatchard分析結果一致。

表1 MIPR的吸附等溫模型參數

2.2.2選擇性吸附分別選取4種尼泊金酯(MP、EP、PP和BP)，以及另外兩種化妝品中常用的物質苯甲酸(BA)和檸檬酸(CA)作為對照品，測定MIPR的吸附選擇性。MIPR和NIPR的選擇性吸附實驗結果如圖4所示，MIPR對4種尼泊金酯均有較高的吸附容量，對模板BP的吸附容量最高，這是由于MIPR中存在與模板BP相匹配的印跡孔穴及結合位點，對模板表現出較好的特異性和較高的吸附能力；對同屬于Parabens的MP、EP、PP也具有較好的吸附容量，這是因為MP、EP、PP與BP不僅結構相似，與聚合物相作用的位點也相同，所以吸附容量也較大；而對不屬于Parabens的BA、CA的吸附容量較低(17.1 mg/g、15.0 mg/g)，這是由于BA、CA與BP的分子結構存在明顯差異，且沒有相應的識別位點，不能進入印跡孔穴，無特異性吸附，只有物理吸附作用。而NIPR對6種物質的吸附容量沒有明顯差異，是由于聚合物中沒有特定的孔穴，對6種物質均只存在物理吸附，吸附容量均較小且無明顯差異。

2.3 實際樣品分析中的應用

2.3.1方法建立將分子印跡固相萃取(MISPE)與HPLC法相結合建立分析方法，并以回收率和相對標準偏差(RSD)為指標對方法進行評價，MP、EP、PP、BP在0.1～10 μg/mL范圍內線性良好，R2=0.9967，對樣品中對羥基苯甲酸酯的加標回收率測定結果見表2。對模板分子BP的加標回收率最高為96.0%，這是由于MIPR對BP的高吸附容量，經洗脫液將BP洗脫后，能達到良好的分離富集效果，故回收率最高。對于同屬于尼泊金酯類的另三種酯，回收率也較高(81.5%～91.0%)，這是因為MIPR可以結合與模板空間結構相似的MP、EP和PP，所以對另3種酯也有較高的吸附能力。對4種尼泊金酯的檢出限為0.0185～0.0334 μg/g，定量限為0.0617～0.111 μg/g。

表2 BB霜樣品的測定結果及回收率(n=3)

圖5 BB霜樣品MISPE前后色譜圖Fig.5 Chromatograms of BB cream before and after MISPE

2.3.2實際樣品色譜圖以MIPR為固相萃取材料，對BB霜樣品中的對羥基苯甲酸酯類化合物進行富集純化，其色譜圖見圖5。由圖可知，MISPE萃取后，有效去除了基質干擾，樣中的對羥基苯甲酸酯類化合物得到明顯富集，4種酯含量在0.162～0.385 μg/g之間，符合中國化妝品衛生規范[3]。

3 結論

采用RAFT-沉淀聚合法，制備了對羥基苯甲酸丁酯分子印跡聚合物，與傳統法相比該聚合物形貌規則，對模板分子的吸附能力更強。經數學模型驗證，存在兩類結合位點，吸附過程屬于多層吸附。選擇性吸附實驗表明，其對對羥基苯甲酸酯具有良好的組選擇性。將其作為固相萃取填料結合UPLC，對BB霜樣品中的痕量MP、EP、PP、BP進行富集分析，回收率在81.5%～96.0%之間，RSD%≤5.6%。方法檢出限和定量限均低于國家標準。