湖北省一例豬鏈球菌的分離與鑒定

高婷　袁芳艷　劉澤文

摘要：從湖北省武漢市江夏區某豬場具有嚴重呼吸道癥狀的疑似病例中，通過臨床解剖采集豬的腦組織、肺組織、扁桃體組織、關節液等病料進行細菌的分離培養、革蘭氏染色、菌落形態觀察、PCR鑒定及藥敏試驗。結果表明，分離到的一株細菌為豬鏈球菌，經PCR分型鑒定結果為2型豬鏈球菌，藥敏試驗顯示，該菌對阿莫西林、氨芐西林高度敏感，為豬場用藥提供了參考依據。

關鍵詞：豬鏈球菌；分離；鑒定；耐藥性

中圖分類號：S858.28 文獻標識碼：A 文章編號：1007-273X（2018）10-0005-02

豬鏈球菌（Streptococcus suis，SS）是一種重要的人獸共患傳染病的病原菌，其不僅可以感染豬導致敗血癥、肺炎、腦膜炎、關節炎以及心內膜炎等，引起斷奶仔豬或育肥豬死亡，給養豬業造成重大的經濟損失，還可以感染人導致敗血癥型休克甚至死亡，嚴重威脅著人類的身體健康和生命安全[1，2]。本研究對湖北省武漢市江夏區某豬場采集了疑似病豬的腦、肺臟、扁桃體、關節液等病料，進行了細菌分離培養及鑒定，通過分型及藥敏試驗，初步了解了該豬場鏈球菌病發病情況，篩選出了高敏感藥物，為豬場臨床用藥選擇以及接種與血清型相符的疫苗進行預防提供了參考依據。

1 材料與方法

1.1 病料采集

從湖北省武漢市江夏區某豬場采集發病豬的腦、肺臟、扁桃體、關節液等病料。

1.2 培養基及試劑

胰蛋白大豆瓊脂（TSA）購自Difco公司；革蘭氏染色液購自珠海貝索生物技術有限公司；新生牛血清購自浙江天杭生物科技股份有限公司；無菌脫纖綿羊血均購自南京茂捷微生物科技有限公司；藥敏紙片購自北京天壇藥物生物技術開發公司；2×Taq mix、2 000 DNA Marker均購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.3 培養基的配置

TSA固體培養基：取TSA培養基粉末4 g，溶于100 mL超純水中，115 ℃滅菌15 min，冷卻至50 ℃加新生牛血清10 mL，傾倒平皿，4 ℃保存備用。血平皿：TSA固體培養基滅菌后冷卻至50 ℃加無菌脫纖綿羊血10 mL，傾倒平皿，4 ℃保存備用[3]。

1.4 細菌分離鑒定

1.4.1 細菌的分離培養 無菌采取豬病料均勻涂布于血平皿培養基上，37 ℃溫箱中培養12 h后，挑選可疑單個鏈球菌菌落純化，37 ℃培養12 h，觀察細菌的生長情況。

1.4.2 鏡檢 挑取TSA平板上的單菌落，革蘭氏染色后用光學顯微鏡觀察細菌的顏色和形態[4]。

1.4.3 生化鑒定 挑取TSA平板上的單菌落，搖菌培養至對數期，將菌液接種乳糖、甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖和麥芽糖等生化鑒定管，置于37 ℃培養24 h，觀察結果。

1.4.4 PCR分型 參照文獻設計豬鏈球菌與豬鏈球菌2型特異性引物[5，6]，用于豬鏈球菌的鑒定和分型，引物序列見表1。挑取疑似SS并純化的單菌落裂解，作為PCR擴增的模板，空白對照用等體積的去離子水代替模板，陽性對照為實驗室保存的2型豬鏈球菌。

1.5 藥敏試驗

將分離純化的菌株按常規方法進行藥敏試驗。

2 結果與分析

2.1 細菌的形態特征

分離到的細菌在加血清的TSA上菌落呈半透明、光滑、圓形突起的細小菌落，順著光線看去菌落泛著藍光。在血平板上可見生長均一的細菌，菌落周圍有α溶血環。革蘭氏染色為革蘭氏陽性菌，卵圓形，鏈狀，鏈的長短由2～5個球菌組成。

2.2 生化鑒定結果

生化鑒定結果顯示，分離的疑似菌脲酶試驗、氧化酶試驗、吲哚試驗、M-R 試驗、V-P試驗、觸酶試驗均為陰性；發酵葡萄糖、蔗糖、果糖、海藻糖、乳糖、麥芽糖、棉實糖、七葉苷、水楊苷等碳水化合物；不發酵木糖、山梨醇、甘露醇、阿拉伯糖、菊糖；符合豬鏈球菌的生化特征。

2.3 PCR擴增結果

PCR產物瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，用豬鏈球菌特異性基因16srRNA的引物能擴出目的條帶，標準豬鏈球菌和分離株均在1 066 bp處（圖2）；用2型豬鏈球菌特異性基因cps2J的引物能擴出目的條帶，標準豬鏈球菌和分離株均在557 bp處（圖2），與預期片段一致，測序與豬鏈球菌SC19序列一致，證明所分離菌株為2型豬鏈球菌。

2.4 藥敏試驗結果

對分離的2型豬鏈球菌進行了14種抗菌藥物的耐藥性試驗，結果顯示，分離菌株對強力霉素、卡那霉素、四環素、林可霉素、頭孢曲松、阿米卡星、慶大霉素、頭孢噻肟等產生耐藥性，對環丙沙星、阿莫西林和氨芐西林藥物高度敏感（表2），臨床上可用該藥對發病豬進行治療。

3 討論

根據莢膜多糖的差異，豬鏈球菌可分為33個血清型[7，8]，其中2型是毒力最強的優勢血清型[2，5，7，9，10]，其不僅可以感染豬導致敗血癥、肺炎、腦膜炎、關節炎以及心內膜炎等，引起斷奶仔豬或者育肥豬死亡，給養豬業造成重大的經濟損失，還可以感染人導致敗血癥型休克甚至死亡，嚴重威脅著人類的身體健康和生命安全[1]。本研究從湖北省武漢市江夏區某豬場分離出一株細菌，經革蘭氏染色確定為革蘭氏陽性菌，隨后采用生化鑒定方法和PCR技術，證實該菌為2型豬鏈球菌。藥敏試驗結果顯示，2型豬鏈菌對強力霉素、卡那霉素、四環素、林可霉素、頭孢曲松、阿米卡星、慶大霉素、頭孢噻肟產生耐藥性，對環丙沙星、阿莫西林和氨芐西林藥物高度敏感。臨床上，建議采用藥敏試驗篩選出高敏感藥物進行治療，可很大程度上改善病情，并建議在生產實踐中注射含有2型豬鏈球菌的多價疫苗，以期更好地預防豬鏈球菌病的發生和流行。

參考文獻：

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