植物子葉生理功能的研究進展

王英男，彭曉媛，華曉雨，臧 威，閻秀峰，藺吉祥

(東北林業大學鹽堿地生物資源環境研究中心/東北鹽堿植被恢復與重建教育部重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150040)

子葉(cotyledon)是植物種子的重要組成部分，在種子萌發與幼苗發育初期起到關鍵作用[1]。無胚乳植物種子在萌發過程中，子葉肥厚，貯藏著淀粉、脂肪酸以及蛋白質等營養物質，為種子萌發提供所需物質和能量[2]。而對于有胚乳種子，子葉通常并不發達，但可以從胚乳中吸收并轉運一定的營養物質，供胚發育[3-4]。在幼苗發育初期，一些植物的子葉能夠在第一片真葉具備光合能力之前，通過光合作用為幼苗提供大量的光合同化物，子葉還能夠感知光信號，并通過信號分子的長距離傳遞，從而調控幼苗的發育[5]。此外，子葉還能夠通過形態與生理功能的變化，參與幼苗抵御外界逆境脅迫的過程[6]。因此，子葉對于種子萌發、幼苗形成以及植物生活史的完成均有極其重要的意義。

目前，對于子葉生理功能的報道還很少見，已有研究多集中于鹽堿、水淹等逆境脅迫下子葉生理功能的變化[7-8]、子葉缺失對幼苗生長的影響[9-10]以及子葉離體組織培養[11-12]等方面，但對子葉功能系統性的總結還從未見報道?；诖?，本文從子葉的分類及功能、幼苗發育初期子葉相關的重要生理過程等方面進行歸納與總結，分析當前研究中存在的問題與不足，并提出研究展望，以期為相關研究提供參考。

1 子葉類型

1.1 單子葉與雙子葉

子葉是植物最早出現的葉，而不同植物子葉數目也有所差異，因此可以將子葉數目作為植物分類的依據。英國博物學家約翰雷(John Ray)在《植物新方法》中第一次提出有的植物有2片子葉，而有的植物只有1片子葉，這對認知植物分類學有著重要的科學意義。隨著植物分類學的不斷發展，植物學家根據成熟胚中子葉的數目對被子植物進行分類，成熟胚只有1片子葉的稱為單子葉植物(Monocotyledon)，如水稻(Oryzasativa)、小麥(Triticumaestivum)、玉米(Zeamays)、洋蔥(Alliumcepa)等。有2片子葉的稱為雙子葉植物 (Dicotyledon)，如豆類、瓜類、棉花(Gossypiumspp.)、油菜(Brassicanapus)、蓖麻(Ricinuscommunis)等(圖1)[13-14]。

1.2 出土型子葉與留土型子葉

不同植物的種子在萌發過程中，由于胚軸的生長速度不同，幼苗形態也存在一定差異。在種胚中，胚軸是連接胚芽與胚根的營養器官，同時也與子葉相連。由子葉著生點到第一片真葉之間的胚軸為上胚軸；由子葉著生點到胚根的一段為下胚軸。依據上、下胚軸在種子萌發時生長速度的不同，可以將植物子葉分為出土型子葉與留土型子葉。如蓖麻種子在萌發時，胚根首先突破種皮，伸入土中，形成主根，然后下胚軸加速伸長，將子葉和胚芽一同頂出土面，因此蓖麻的子葉為出土型子葉，大豆(Glycinemax)、棉花、油菜和各種瓜類的子葉均屬于此類型子葉。而在蠶豆(Viciafaba)種子萌發時，胚根先突破種皮，向下生長成為主根。由于上胚軸的伸長，胚芽不久就被頂出土面，而下胚軸的伸長并不明顯，子葉始終埋在土中。因此，蠶豆的子葉為留土型子葉，蕓豆(Phaseolusvulgaris)、荔枝(Litchichinensis)、柑橘(Citrusreticulata)、小麥、玉米等的子葉都屬于留土型子葉(圖1)。

圖1 小麥籽?？v切圖、蓖麻種子結構、蓖麻的出土型子葉、蠶豆的留土型子葉Fig. 1 Longitudinal section of a wheat grain, castor seed structure, the cotyledons of castor that epigaeous seedling, and the cotyledons of broad bean that hypogaeous seedling

2 子葉功能

2.1 營養貯藏

一般來說，胚乳是種子集中貯藏營養的地方，但也有一些植物種子不具胚乳，這類種子在生長發育時，胚乳的養料通常被胚吸收，并轉入子葉中貯藏，所以成熟的種子里胚乳消失，或僅存一層干燥的薄層，不起貯藏營養的作用。對于此種類型的植物種子，子葉起到了貯藏營養的功能。大豆、落花生(Arachishypogaea)、蠶豆、棉、油菜、瓜類等的子葉，都具有營養貯藏的功能。而不同類型植物子葉中所貯藏的養分種類也有較大差異，在油菜、黃瓜(Cucumissativus)子葉中主要以油脂為貯藏物質，并以三酰甘油的形式存儲于脂體中[15-16]。當種子萌發后，三酰甘油經脂肪酶催化釋放脂肪酸，通過脂肪酸代謝為種子萌發和幼苗早期生長提供營養物質和能量[17-18]。而大豆子葉內含蛋白質較多，主要以沉降系數為7S、11S貯藏蛋白為主[19]。種子萌發后，貯藏蛋白經蛋白酶催化降解為氨基酸，隨后通過氨基酸代謝，一方面為種子萌發和早期幼苗生長提供內源性的氮源及碳骨架，另一方面通過氨基酸代謝的中間產物α-酮戊二酸參與三羧酸循環，為種子萌發和早期幼苗生長提供能量[20]。

2.2 光合作用

種子萌發后，子葉出土型的植物(如大豆)，一般子葉比較肥厚，其貯藏的營養消耗殆盡后，就干癟脫落。而棉花等植物種子子葉較薄，出土后立即展開變綠，開始進行光合作用，待真葉展開后，子葉枯萎脫落。此外，蓖麻等植物子葉出土后，能夠長時間進行光合作用，即使真葉展開后一段時間也并不脫落。這種具有光合能力的子葉在真葉成為主要光合貢獻者之前，能夠為幼苗的生長提供大量的光合同化物。前人已有較多研究報道了子葉光合作用對幼苗生長的影響，如對白菜(Brassicapekinensis)子葉遮光的研究中發現，子葉遮蔽后幼苗株高及生物量與對照組相比分別下降了31.1%和24.9%[21]。而Hou等[22]在甜瓜(Cucumismelo)子葉生長對幼苗光合作用貢獻的研究結果中表明，甜瓜子葉的光合貢獻率隨苗齡的增加而降低，在子葉展平期為100%，進入伸蔓期后僅為5%。對黃瓜幼苗的研究中發現，黃瓜幼苗子葉僅用50%的光合面積提供了近80%的CO2同化量。因此，在植物幼苗發育初期，子葉為幼苗的生長提供了大量的光合同化物，促進了幼苗的發育[23]。

2.3 脅迫防御

幼苗在生長發育過程中，會受到干旱、鹽堿、溫度、蟲害等諸多生物與非生物脅迫的影響。而作為植物生長發育過程中最早出現的葉器官，子葉在抵御脅迫時也起到了重要作用。在長期進化的過程中，子葉形成了一系列的防御機制，以適應和抵御不同類型的脅迫。如在蘿卜(Raphanussativus)子葉受害蟲啃食的研究中發現，當子葉受到害蟲啃食后，產生了形態上的防御，其受損子葉上下表皮顆粒明顯增多，且上表皮毛明顯增多，同時表皮毛上也存在顆粒狀復合體[6,24]。在對水稻子葉受白葉枯菌感染的研究中發現，感染后的水稻子葉中與抗病途徑相關OsPR1B基因表達量顯著上調，從而激活表達下游相應的病程相關基因表達，進而對抗病相關的信號途徑產生影響，使水稻對白葉枯菌產生防御能力[25-26]。此外，子葉在非生物脅迫下同樣能夠對幼苗起到保護作用。如對鉛脅迫下海欖雌(Avicenniamarina)子葉生理功能研究中發現，鉛脅迫下海欖雌子葉內可溶性糖含量顯著下降，而在幼苗根和葉中可溶性糖含量顯著增加，說明子葉在鉛脅迫下為根、葉提供了營養，補償了由于鉛脅迫所造成的幼苗養分虧缺，從而在一定程度上增強了幼苗抵御鉛脅迫的能力[27]。而在對鹽脅迫下囊果堿蓬(Suaedaphysophora)的研究中發現，與真葉相比，子葉中Na+離子含量較高，且有著較高的Na+/K+，說明子葉起到了一定富集Na+的作用，從而降低了堿蓬幼苗其他部位Na+含量，緩解了鹽脅迫對幼苗的損傷[28]。

總之，子葉在植物生長中的功能主要就是以上3種(表1)。

3 幼苗發育初期子葉相關重要生理過程

3.1 貯藏物質動員

3.1.1蛋白質動員 種子貯藏蛋白在種子成熟期合成，這類蛋白沒有酶催化活性，主要為幼苗的生長提供所需的氮源和碳源。在豆科植物刺毛黧豆(Mucunapruriens)子葉超微結構及生理研究中發現，子葉中貯藏蛋白的動員早在種子萌發結束前就已開始，且動員時間主要集中在種子吸脹后48～72 h，晚于胚軸中蛋白質動員[29]。在豌豆(Pisumsativum)的研究中也發現了相似的結果[30]。貯藏蛋白的降解主要通過種子成熟時合成及在種子萌發后蛋白質體中新合成的蛋白酶催化[31]，而蛋白質動員過程中蛋白酶活性的調節對于幼苗的發育有著極為重要的意義，通過蛋白酶活性的調節使貯藏蛋白從積累轉變為動員過程，從而為種子的萌發及幼苗的發育提供養分[32](表2)。蛋白酶催化的蛋白質動員過程主要在處于適宜酸性pH的蛋白質貯藏泡(PSVs)中進行[33]。He和Tan-Wisson[34]運用免疫電鏡及激光共聚焦掃描電鏡觀察了大豆子葉PSVs中貯藏蛋白的水解過程，提出貯藏蛋白動員過程主要受PSVs酸化程度的調控。而對南瓜(Cucurbitapepo)幼苗子葉PSVs的進一步研究中發現，PSVs維持較為適宜的酸性pH主要依靠兩種膜結合質子轉運蛋白H+-ATPases與H+-PPases實現[35]。Wilson等[36]對大豆子葉蛋白質動員過程的研究中發現，對萌發后3和6 d的子葉進行H+-PPases抑制劑亞氨二磷酸鹽(IDP)處理后，蛋白質動員過程差異較大，萌發后6 d子葉的IDP抑制處理蛋白質動員效率顯著低于萌發后3 d的IDP抑制處理，說明在幼苗發育初期主要由H+-ATPases調節PSVs中的pH，進而調節蛋白質動員過程，而在幼苗發育中后期則主要由H+-PPases調節。

表1 子葉在植物生長過程中的功能Table 1 Function of cotyledons in plant growth processes

表2 幼苗發育初期子葉蛋白質動員Table 2 Cotyledon protein mobilization at the early stage of seedling development

3.1.2脂肪酸動員 油脂是油料作物種子的主要貯藏物質，主要存儲在子葉等貯藏組織細胞的特定細胞器——油體(Lipid bodies)中[37]。在向日葵(Helianthusannuus)等油料作物種子中，脂肪酸以亞油酸[LA，(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dienoic acid]的形式，經酯化作用存儲于甘油三脂(TAGs，triacylglycerols)中[38]。油脂的動員主要在子葉中分步進行，首先油體中的TAGs被脂酶水解為LA和甘油。甘油進入細胞質，磷酸化為二醛丙酮磷酸，經糖酵解過程轉化為丙酮酸，然后經三羧酸循環(tricarboxylic acid cycle，TCA)氧化為CO2和H2O。二羥丙酮磷酸也可以在醛縮酶的催化下生成己糖。LA降解則在乙醛酸循環體中進行，Behrends等[39]、程紅焱和宋松泉[40]運用同位素標記技術研究脂肪酸在黃瓜幼苗子葉中的代謝過程，發現在子葉中脂肪酸降解主要通過β氧化途徑降解為乙酰輔酶A，隨后乙酰輔酶A在異檸檬酸裂解酶的作用下通過乙醛酸循環生成丙酮酸，進而參與糖異生過程，生成大量糖類，并轉運到胚軸，以供幼苗生長之需。在擬南芥(Arabidopsisthaliana)幼苗生長初期，子葉中β氧化在脂肪酸轉化為糖的過程中起到了關鍵作用[41]。

子葉中脂肪酸代謝過程除β氧化途徑外，還存在脂氧合酶(lipoxygenase，LOX)催化的脂肪酸氧化途徑[42]。對子葉脂肪酸代謝的研究發現，向日葵與黃瓜幼苗子葉中均存在脂氧合酶催化的脂肪酸氧化途徑，并認為該途徑主要功能是參與含氧脂肪酸衍生物的降解[43]。脂氧合酶是一種含非血紅素鐵的加氧酶，其在生物體內的主要功能是專一催化具有順-1, 4-戊二烯結構的多元不飽和脂肪酸的加氧反應，由脂氧合酶催化的脂肪酸氧化途徑被稱為LOX途徑。該途徑是指在有氧條件下多元不飽和脂肪酸被脂加氧酶催化生成氫過氧化脂肪酸，經一系列分支酶作用，生成具有一定生理功能的化合物的過程。在高等植物體內LOX途徑以18C脂肪酸(亞油酸、亞麻酸等)為初始底物，因此LOX途徑又稱十八碳途徑[44]。根據18C脂肪酸氧化位置的不同，高等植物LOX分為2類，即9-LOX和13-LOX，它們氧化18C脂肪酸分別產生9-(9-HPOD)和13-過氧化氫衍生物(13-HPOD)。Weichert等[45]通過高效液相色譜(HPLC)對黃瓜幼苗子葉LA脂氧合酶途徑代謝產物進行了分析，并對關鍵酶進行了鑒定，發現子葉中LOX主要為13-LOX，能夠催化LA生成13-HPOD，并在乙醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase，ADH)、異構酶(isomerase，ISO)等相應酶的催化下進一步轉化為各種烯醛和烯醇類化合物，為各種次生代謝產物提供合成前體，從而調節幼苗的生長發育(圖2)。

圖2 子葉中脂氧合酶催化的脂肪酸氧化途徑Fig. 2 Fatty acid oxidation pathway catalyzed by lipoxygenase in cotyledon

9-LOX為9-脂氧合酶；13-LOX為13-脂氧合酶；9-HPL為9-過氧化物裂解酶；13-HPL為13-過氧化物裂解酶；ISO為乙醇脫氫酶；ADH為異構酶。

9-LOX, 9-Lipoxygenase; 13-LOX, 13-Lipoxygenase; 9-HPL, 9-Hydroperoxide Lyase; 13-HPL, 13-Hydroperoxide lyase; ISO, alcohol dehydrogenase; ADH, isomerase.

3.2 調控胚根發育

光形態建成是植物依賴光來控制細胞的分化、結構和功能的改變，最終匯集成組織和器官的建成，即以光控制植物發育的過程[46]。光形態建立后，胚根伸長，并開始吸收土壤中的水分和礦質營養[5,47]。而子葉在幼苗光形態建立過程中對胚根的伸長起到了重要的調節作用，從而實現對種子貯藏營養的合理利用。對擬南芥子葉影響胚根生長的研究中發現，子葉光合產物蔗糖是調節胚根伸長的長距離信號的關鍵。當種子萌發處于黑暗中，種子中貯藏的有限養分主要供胚軸伸長，而胚根伸長幾乎停滯，當胚軸不斷伸長，直至將子葉頂出土面后，子葉展開，隱花色素、光敏色素等光信號受體感知光信號后，通過自身構象變化與下游信號分子相互作用；光敏色素相互作用因子(phytochrome-interacting factors,PIFs)是一類能夠與光敏色素相互作用的轉錄因子家族，其中PIF3對葉綠素合成調節酶基因HEMA1、GUN5以及光合系統PSI中LHCA1、PsaE1基因的表達起負調控作用[48]；PIF1則能夠與原葉綠素酸酯氧化還原酶POR的啟動子相互作用，控制葉綠素的合成[49]。當光敏色素感受光信號后與PIFs相互作用并轉移至核內，啟動自身磷酸化進而啟動子葉光合作用相關基因的表達[50]。當子葉光合作用啟動后，通過向胚根輸送大量的光合作用產物蔗糖，促進胚根的伸長，使胚根能夠從土壤中獲取幼苗生長所需的水分及礦質營養。

3.3 子葉綠化

子葉綠化標志幼苗具備了通過自身光合作用為植物生長提供營養的能力，其對幼苗根系的生長以及真葉的形成與發育起著至關重要的作用，因此子葉綠化是幼苗發育初期的一個重要生理過程(圖3、表3)[51]。子葉的綠化過程包括子葉出土前在無光條件下的葉綠素前體原葉綠素酸酯(Pchlide)的合成與積累，以及出土后在有光條件下積累Pchlide的還原[52-53]。其中Pchlide的合成與積累過程是一個多步酶促反應，由底物谷氨酸開始，生成5-氨基酮戊酸(5-ALA)后，2分子5-ALA合成含吡咯環的膽色素原(PBG)，4個PBG分子聚合成原卟啉Ⅸ，隨后與鎂原子結合，形成鎂-原卟啉IX經酶催化形成原葉綠素酸酯。Pchlide的還原過程則主要由原葉綠素酸酯氧化還原酶催化，在光照條件下生成葉綠素酯a。隨后，葉綠素酯a在不同酶催化作用下生成葉綠素 a等光合色素，使子葉葉綠體具備了捕光能力，開始進行光合作用，為幼苗初期的生長發育提供光合同化物。

Pchlide在光照條件下易產生活性氧(ROS)，能夠對細胞膜產生嚴重的光氧化損傷。因此，合理地調節Pchlide在子葉中的含量對于子葉綠化過程的順利進行，以及幼苗的正常發育均具有較為重要的意義。Glu-tRNA還原酶是5-ALA合成的限速酶，通過對其酶活性的調節能夠從源頭控制Pchlid在子葉中的含量。Flu蛋白是一個分子量27 kD、定位于質體的膜蛋白，由apel等在過量積累原葉綠素酸酯的擬南芥Flu缺陷型中被鑒定[54]。Flu蛋白能夠與Glu-tRNA還原酶C端的卷曲螺旋結構域特異性結合，從而抑制Glu-tRNA還原酶活性[55]。對油菜子葉5-ALA調控的研究發現，當Pchlide過量時通過Flu蛋白參與Glu-tRNA還原酶活性的負反饋調節。在黑暗中生長的Flu缺陷型植株中，由于Glu-tRNA還原酶活性缺乏Flu蛋白的抑制，原葉綠素酸酯大量積累[56]。在對挪威云杉(Piceaabies)子葉的研究中也有相似的結果，暗處理下Flu蛋白積累量顯著高于光照處理，Glu-tRNA還原酶活性明顯降低，從而降低了5-ALA和合成速率，限制了Pchlide在子葉中的積累[57]。除子葉中Flu蛋白對Pchlide含量的調控外，植物激素乙烯在子葉Pchlide含量調節中也發揮了較為重要的作用。Zhong等[58]通過啟動子融合GUS的方法，分析了擬南芥子葉中植物激素乙烯對原葉綠素酸酯氧化還原酶(POR)基因表達的影響，發現通過AgNO3處理阻斷乙烯信號轉導后，子葉中POR基因未表達，該結果證實了乙烯能夠調節POR基因的表達，進而影響了Pchlid在子葉中的含量。而在進一步的研究中，通過對擬南芥Flu缺陷型子葉進行乙烯處理，顯著降低了子葉中Pchlide的含量，且ROS也有較大幅度的下降，說明子葉中存在一種由乙烯調控、不依賴Flu蛋白的Pchlide調節方式[58]。

Glu為谷氨酸; ATP為三磷酸腺苷；NADPH為還原型輔酶Ⅱ；GSA為L-谷氨酸-1-半醛; 5-ALA為5-氨基酮戊酸; PBG為膽色素原; HMB為羥甲基后膽色素原; UROⅢ為尿卟啉原Ⅲ; CoprogenⅢ為糞卟啉原Ⅲ; Protoporphyrinogen Ⅸ為原卟啉原Ⅸ; ProtoⅨ為原卟啉Ⅸ; Mg-ProtoⅨ為鎂-原卟啉Ⅸ; Mg-PmtoⅨ-Me為鎂-原卟啉Ⅸ單甲酯; Dv-Pchlide為二乙烯原葉綠素酸脂; Pchlide為原葉綠素酸脂; Chlide a為葉綠素酸脂a; Chl a為 葉綠素a; Chlide b為葉綠素酸脂b; Chl b為葉綠素b; Heme為亞鐵血紅素;Flu為熒光蛋白；PHY為光敏色素。

Glu, glutamyl; ATP, Adenosine triphosphate; NADPH, nicotinamide adenine dinucleotide phosphate; GSA, L-glutamic acid 1-semialdehyde; 5-ALA, 5-Aminolevulinic acid; PBG, Porphobilinogen; HMB, Hydroxymethylbilane; UROⅢ, Uroporphyrinogen Ⅲ; Coprogen Ⅲ, Coproporphyrinogen Ⅲ; Proto Ⅸ, Protoporphyrin Ⅸ; Mg-Proto Ⅸ, Mg-protoporphyrin Ⅸ; Mg-Pmto Ⅸ-Me, Mg-protoporphyrin Ⅸ monomethyl ester; Dv-Pchlide, Divinyl protochlorophyllide; Pchlide, Protochlorophyllide; Chlide a, Chlorophyllide a; Chl a, Chlorophyll a; Chlide b, Chlorophyllide b; Chl b, Chlorophyll b; Heme, ferroheme; Flu, Fluorescent protein; PHY, Phytochrome.

表3 子葉綠化過程中的催化酶Table 3 Catalytic enzymes in the process of cotyledon greening

4 展望

子葉在高等植物發育過程中參與了諸多重要的生理過程，不但能夠為幼苗的發育提供營養及能量，還能夠對幼苗的發育過程進行調節，且在幼苗響應生物與非生物脅迫過程中也起到了關鍵作用。綜合分析發現，雖然關于子葉生理功能的研究已見大量報道，但研究大多集中于宏觀水平，諸多機制還不明確，且缺乏對分子機理的深入理解，今后的研究需要在以下幾個方面進一步深入：

1)利用基因芯片技術檢測子葉綠化過程中基因表達水平的變化，同時要充分考慮不同植物的種類、相關基因的亞細胞定位以及外界條件變化，以便更確切地分析子葉綠化過程的影響機制及其調控特點。

2)結合轉錄組學與蛋白組學技術手段，在基因和蛋白層次解析子葉響應生物與非生物脅迫過程中的分子調控網絡，鑒別子葉響應脅迫的相關調控基因與參與防御作用的功能蛋白質，從而更加系統地解析子葉在抵御生物與非生物脅迫過程中的途徑與機理。

3)利用代謝組學高通量檢測的技術特點并結合生物信息學的方法，分析油料作物子葉中脂肪酸的代謝過程，分析其代謝網絡結構、限速步驟，從而更加全面、系統地理解子葉在貯藏物質動員過程中的重要作用。