STR掃描技術對融水小型豬群體遺傳結構的分析*

劉 科 施赫赫 譚巧燕 陳 淦 唐小江

(1. 廣東省醫學實驗動物中心，佛山 528248)(2. 廣東貝格生物科技有限公司，佛山 528100)

融水小型豬是源自廣西融水縣苗寨的小黑豬，具有體型小、性情溫馴、母性較好、產仔力強等特點，具有培育成標準化實驗用小型豬的有利特點[1]。我們于2012 年將該豬種源引到廣東三水繁育，建立了基礎種群的系譜檔案，已繁殖出F1 代和F2 代，參照北京市地方標準[2]初步建立了融水小型豬的質量控制標準，并開展了融水小型豬實驗動物化研究，包括環境、營養、生長、生理生化、組織病理、線粒體DNA結構和系統進化等[1, 3-6]。為了進一步掌握融水小型豬群體遺傳結構，本文通過STR(Short tandem repeat)掃描技術分析了融水性小型豬F1代群體的遺傳結構。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動物樣品：在廣東省醫學實驗動物中心小型豬研究基地融水小型豬F1代群體中隨機抽取非同窩的30頭，年齡性別不限。各融水小型豬具體信息見表1。

1.1.2儀器及試劑：EDC-810 PCR儀，北京東勝創新生物科技有限公司；3730XL基因測序儀，ABI公司；Allegra 25R臺式高速冷凍離心機，Beckman(貝克曼)公司；GeneScanTM-120 GeneScan，ABI公司； Taq DNA 聚合酶、dNTP購于Fermentas公司；ROX標記分子量內標、GK1041，上海捷瑞生物工程有限公司合成。

表1 融水小型豬樣本信息

1.1.3STR位點：選用北京市地方標準封閉群實驗用小型豬的遺傳質量監測提供的25個微衛星位點及引物序列，交由上海捷瑞生物工程有限公司合成引物。具體位點名稱、引物序列及PCR反應條件見表2。

表2 25個STR位點名稱、引物序列、片段大小及PCR條件

1.2 方法

1.2.1DNA提?。河脽o菌EDTA抗凝采血管取融水小型豬前腔靜脈血4 mL，用上海捷瑞生物工程有限公司生產的GK1041試劑盒按操作說明書提取DNA。

1.2.2PCR及瓊脂糖凝膠電泳：PCR反應體系為15 μL，其中10×buffer 1.5 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.15 μL，DNTP 10 m mol/L 0.3 μL，Taq酶0.3 μL，5～10 ng基因組DNA 1μL，純水(H2O)：10.25 μL。擴增條件：94 ℃預變性3 min，94 ℃變性15 s，最適退火溫度15 s，72 ℃延伸30 s，35個循環，接72 ℃繼續延伸3 min，擴增產物4 ℃保存。取部分擴增產物8 μL經1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，成相拍照。

1.2.3STR掃描: 根據瓊脂糖凝膠電泳結果估計PCR產物濃度，并將產物稀釋10倍后，與ROX 500內標混勻，其中10倍稀釋的PCR產物1.5 μL，ROX標記的分子量標記0.25 μL，超純去離子甲酰胺12.5 μL，95 ℃ 5 min，迅速冰浴3 min，置于ABI3730測序儀樣本架上進行毛細管電泳檢測。本次實驗檢測為三色通道熒光檢測體系，分別為FAM、HEX、ROX，實現每通道同時檢測兩種STR類型(根據標記的不同，這里為FAM和HEX)。

1.2.4STR掃描結果分析：掃描結果若只有一個主波的為純合基因型，如果有兩個主波則為雜合基因型。同時將每個STR掃描標記的基因片段大小按照由小到大的順序分別標記為a、b、c、d、e等。將30頭融水小型豬的25個微衛星標記的基因型按照aa、ab、bc等格式輸入Popgene32軟件，分析融水小型豬觀察等位基因數、有效等位基因數、香隆指數、有效雜合度等。

2 結果

2.1 25個位點PCR電泳凝膠圖

瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，全部25個位點擴增良好，電泳條帶清晰，電泳凝膠結果見圖1。

圖1 25個位點PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2 STR掃描結果

STR掃描結果顯示，全部25個微衛星位點具有豐富的多態性，純合及雜合基因型從掃描圖中清晰可見。SW951位點STR掃描結果(選取2個個體)見圖2、3。

圖2 SW951位點純合子基因型STR掃描結果

圖3 SW951位點雜合子基因型STR掃描結果

2.3 融水小型豬群體遺傳分析結果

將從STR掃描得到的信息輸入Popgene32后分析得到30頭融水小型豬在25個位點上的觀測等位基因數，有效等位基因數，香隆指數及有效雜合度原始數據及匯總見表3。30頭融水小型豬在25個位點上的平均觀測等位基因數為9.4400，平均有效等位基因數為5.2966，平均香隆指數為1.8085，平均有效雜合度為0.7737。

表3 30頭融水小型豬在25個位點上的觀測等位基因數、有效等位基因數、香隆指數、有效雜合度

3 討論

微衛星DNA(Microsatellite DNA)，又稱短串聯重復序列(Short tandem repeat, STR)或稱簡單重復序列(Simple sequence repeats, SSR)，是一種以2～6個核苷酸為基本重復單位的簡單串聯重復序列。近年來，微衛星標記因具有分布廣、數量多、高度多態性、具有共顯性等優點，被作為一種重要的遺傳工具廣泛應用于各類實驗動物的遺傳檢測和評定研究。特別是近年來快速發展和具有廣泛應用前景的DNA全自動測序儀的毛細管凝膠電泳新技術(STR掃描技術)，具有微量、高度自動化、結果更加準確等明顯優勢，成為微衛星檢測的發展方向。本試驗選用北京市地方標準封閉群實驗用小型豬的遺傳質量監測(DB11/T 828. 3—2011)提供的25個微衛星位點，對建立的融水小型豬F1代群體進行遺傳檢測，其位點引物涵蓋了小型豬17對常染色體及X性染色體，試驗結果顯示，18對染色體均得到對應的微衛星位點，全部25個位點擴增良好，均可擴增出目的條帶，電泳條帶清晰，對30個融水小型豬樣本檢測，各位點多態豐富，25個位點觀察等位基因數5～16，有效等位基因數2.3407～10.1695，平均有效等位基因數為5.2966，等位基因較多，表明選取的25個微衛星位點適用于融水小型豬遺傳結構分析。

融水小型豬是源自廣西融水縣苗寨的小黑豬，前期研究表明[1,3-6]，融水小型豬具有體型微小、性情溫馴、母性較好、產仔力強等特點，具有培育成標準化實驗用小型豬的有利特點。我們于2012年將該豬種源引到廣東繁育，建立基礎群130頭，其中雌性120頭，雄性10頭。經馴化、選育，建立了F1代融水小型豬群體。目前，已對融水小型豬繁殖群體進行了基礎研究，但群體的遺傳結構還不清楚。本試驗所選取的30頭F1代融水小型豬個體(抽樣F1代群體120頭，雌性90頭，雄性30頭)年齡在1年到3年之間，樣本選擇盡可能避免親緣關系較近個體，基本能夠反應目前融水小型豬群體的總體遺傳概況。試驗結果顯示，30頭F1融水小型豬在25個平均觀測等位基因數為9.4400，平均有效等位基因數為5.2966，說明群體非近親繁殖，基因較穩定。香隆指數是衡量微衛星DNA多態性的指標，香隆指數高則表明該微衛星位點的多態性越好[7]。該融水小型豬F1代群體的平均香隆指數為1.8085，是屬理想范圍，這也與微衛星多態性豐富的數據分析結果相吻合。群體平均有效雜合度是一個群體遺傳多樣性程度的重要指標，能夠反映群體中檢測的基因的雜合狀態。一個理想封閉群的平均有效雜合度在0.5～0.7，若群體雜合度小于0.5則表明群體的遺傳多樣性較差，而大于0.7則表明群體離散度較高，個體間差異偏大[7-9]。該試驗用平均有效雜合度為0.7737，雜合度略偏高，這可能與種源個體來源，及該種群引入后第一代采用分組交配方式繁殖，封閉繁育代數較少，還未形成封閉群相關，同時說明建立融水小型豬封閉群還需進一步培育、繁殖。

本實驗通過STR掃描技術分析了融水小型豬的遺傳結構，為融水小型豬實驗動物化和標準化研究奠定了基礎，有利于融水小型豬群今后繁殖育種計劃的制定，同時也為小型豬遺傳分析方法提供了參考和依據。