急性胰腺炎內質網應激反應機制研究進展

程璐 韓樹堂

南京中醫藥大學附屬醫院，南京 210029

【提要】 胰腺腺泡細胞具有豐富內質網，適應其合成消化酶的生理功能。各種損傷因素引起蛋白質折疊需求與內質網折疊能力失衡，大量未折疊或錯誤折疊蛋白在內質網腔內蓄積，引起內質網應激。內質網應激的過度激活可能是觸發和加重急性胰腺炎胰腺損傷的重要應激機制，涉及未折疊蛋白反應的信號轉導、炎癥反應的加重、腺泡細胞的凋亡、胰腺酶原顆粒自噬等多個方面。

內質網是真核細胞內功能活躍的重要細胞器，其生理功能主要是合成膜蛋白和分泌蛋白，啟動翻譯后修飾，保證蛋白質折疊成正確的空間構像，同時也參與脂質和類固醇代謝。當各種病因(如缺氧、Ca2+超載、氧化應激等)打破內質網平衡時，內質網折疊和修飾功能受損，大量未折疊或錯誤折疊蛋白在內質網腔內蓄積，引起內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)。ERS是一種涉及體內穩態和內質網功能紊亂之間的失衡狀態。新近的研究表明急性胰腺炎(AP)的發生、發展在細胞生物學水平與ERS密切相關，ERS的過度激活可能是觸發和加重胰腺損傷的重要應激機制[1-3]。本文根據近期相關研究進展，探討ERS在AP進程中的作用。

一、內質網應激與未折疊蛋白反應

胰腺腺泡細胞具有豐富內質網，以適應其合成消化酶的生理功能。各種新合成的消化酶被運送至內質網，與伴侶分子免疫球蛋白重鏈結合蛋白(immunoglobulin heavy chain binding protein，BiP)，也稱葡萄糖調節蛋白78(78-kD glucose-regulated protein，GRP78)結合。BiP/GRP78是一種主要定位于內質網的鈣離子結合分子伴侶，借助其水解ATP的耗能過程促進蛋白質正確折疊、進行翻譯后修飾。各種損傷因素作用均可引起內質網蛋白質加工、運輸障礙或攝取、釋放Ca2+障礙，從而引起蛋白質折疊需求與內質網折疊能力失衡，導致蛋白質不能正確折疊、糖基化形成障礙或蛋白質不能形成正常的二硫鍵，內質網內未折疊蛋白或錯誤折疊蛋白堆積，引起ERS。當內質網中未折疊或錯誤折疊的蛋白增多時，應激信號通過內質網膜傳遞到細胞核，繼而引起一系列特定的靶基因轉錄和蛋白質翻譯水平下調，使細胞繼續存活，這種反應稱為未折疊蛋白反應[4](unfolded protein response，UPR)。

胰腺細胞發生ERS初期，UPR被激活，用以恢復內質網穩態，保護細胞生存[5]。UPR通過以下3種內質網跨膜蛋白進行調節：(1)蛋白激酶RNA樣內質網激酶(protein kinase r-like ER kinase，PERK)；(2)肌醇需要酶1α(Inositol-requiring enzyme 1α，IRE1α)；(3)活化轉錄因子6(activating transcription factor 6，ATF6)。UPR的關鍵因素是熱休克蛋白家族成員BiP/GRP78。在非ERS情況下， BiP/GRP78與3種跨膜蛋白結合，維持信號轉導因子在未激活狀態[6]。當內質網腔內大量未折疊蛋白蓄積時，BiP/GRP78即與3種跨膜蛋白解離，轉而與未折疊蛋白結合，使解離后的3種信號轉導蛋白處于活化狀態，進而啟動UPR信號通路。

1．PERK途徑：PERK在胰腺中廣泛高表達，與GRP78/BIP解離后，PERK可通過胞質內結構域的自身二聚化和磷酸化而激活，促使下游的真核生物轉錄起始因子2α(eukaryotic translation initiation factor 2α，eIF2α)磷酸化，進而使翻譯起始mRNA迅速減少，減緩或暫停蛋白質的合成，降低內質網對新合成蛋白折疊需求的壓力[7]。實驗研究表明[8]，PERK缺失的小鼠可在4周大小時出現β細胞為主的胰腺功能不全，6～8周時以腺泡細胞為主。反之，eIF2α磷酸化的缺失增加了β細胞合成大量蛋白質并促進蛋白質折疊的需求，這同樣增加了胰島素原的折疊和錯誤折疊，錯誤折疊蛋白在內質網內堆積，加重了氧化應激[9]。這些現象提示ERS反應中PERK介導的eIF2α磷酸化阻止mRNA翻譯、減少折疊蛋白的負荷而防止錯誤折疊蛋白的聚集，從而使細胞得以存活。

2．ATF6途徑：內質網腔內未折疊蛋白增多，使ATF6與BiP分離，ATF6轉移到高爾基體，被高爾基體S1P(site-1 protease)和S2P(site-2 protease)蛋白酶水解，釋放出N端轉錄激活結構域，產生活化型ATF6入核，結合于啟動子ERS反應元件(ER stress response element，ERSE)，誘導X盒結合蛋白1(X-box-binding protein1，XBP1)轉錄表達，促進蛋白質在內質網腔內的正確折疊[10-11]。

3．IRE1途徑： ERS時，活化的IRE1α切割其底物XBP1前體mRNA，剪接后的mRNA發生翻譯框移，編碼產生有活性的轉錄因子sXBP1。sXBP1誘導的目標基因可以增強內質網蛋白折疊能力，加速錯誤折疊蛋白的降解[12-13]。

UPR的信號轉導高度復雜，ERS可以激活PERK/eIF2α、IRE1/XBP1和ATF6介導的通路阻斷翻譯的進程，減少內質網的蛋白合成負擔，增加伴侶分子以及蛋白折疊相關分子的數量。此外，ERS能激活其相關的分子，如內質網相關蛋白降解(ER-assisted protein degradation，ERAD)基因，可以識別，通過泛素-蛋白酶體通路從內質網內腔清除錯誤折疊的蛋白，并與非內質網相關細胞通路相互作用，最后導致ERS的解除[14]。當內質網紊亂超過細胞的調節能力時，內質網穩態無法得到恢復，ERS逐漸加重，將引起細胞損傷或凋亡。

二、內質網應激與急性胰腺炎

1．ERS參與AP的早期階段：AP的發病機制尚未完全被闡明，病理性腺泡內胰蛋白酶原活化被認為是胰腺炎發生和發展的關鍵。胰腺腺泡細胞的內質網含量豐富，胰蛋白酶原合成于內質網。在蛙皮素誘導的AP模型中，早期的ERS與胰蛋白酶原的活化有關[15]。

在內質網功能紊亂情況下，胰腺細胞更容易受外界刺激影響，內質網的結構在胰腺炎時發生顯著改變。Bhatia等[16]報道，逆行注射?；悄懰徕c到胰管幾分鐘內，腺泡細胞損傷以內質網囊泡粒子的形成為特征，這一現象與ERS相關受體PERK、IRE1、ATF6及其下游通路的激活有關。隨后，多種類型的胰腺炎動物模型研究中，包括注射?；悄懰徕c、L-精氨酸、高脂飲食、胰膽管結扎等造模方式，早期均觀察到內質網形態學的改變，主要表現為內質網局部或廣泛擴張、空泡形成以及核糖體的減少，表明在AP的早期階段即存在ERS[17-20]。

2．ERS與胰腺腺泡損傷：ERS與過度UPR參與胰腺腺泡細胞的損傷及炎癥反應，促進AP發展。 Kubisch等[21]觀察到L -精氨酸誘導的AP大鼠在造模早期就出現了明顯的ERS，其標志為PERK的磷酸化及其下游靶點eIF2α、ATF6移位進入細胞核，以及BiP的上調。其隨后研究[17]也發現，UPR在AP發病中亦起到重要作用，包括分子伴侶BiP表達、PERK磷酸化、XBP1拼接以及CCAAT增強子結合蛋白同源蛋白(CHOP)表達，且不同的促分泌素激活胰腺腺泡細胞中的ERS也不同，只有超生理水平的CCK8與抑制淀粉酶的分泌、胰蛋白酶活化刺激PERK磷酸化以及CHOP表達相關。此外，還觀察到AP病程中內質網伴侶蛋白及UPR關鍵調節分子表達水平的改變，包括BiP、CHOP、PERK、eIF2、ATF6、Xbp1等，以期提高ERS細胞處理未折疊蛋白或抵御其他細胞應激的能力。在蛙皮素和?；悄懰徕c誘導的胰腺炎模型中[22]，早期即出現了UPR關鍵調節分子的表達上調，胰腺細胞中IRE1和BiP的激活發生在?；悄懰徕c給藥后3 h[23]。在精氨酸誘導的重癥急性胰腺炎(SAP)模型中，發現PERK、ATF6和IRE1及其下游信號均被激活[24]，亦提示ERS與胰腺炎腺泡細胞損傷密切相關。

3．ERS與AP炎癥反應加重：ERS在多種疾病中通過核因子-kappaB(NF-κB)通路引起炎癥反應，UPR通過PERK、IRE1和ATF6 3條信號通路激發炎癥反應，進而激活NF-κB信號通路[25-26]。AP時，ERS通過NF-κB被激活，其中鈣離子和蛋白激酶C的病理學改變是涉及NF-κB激活的主要因素[27]。ERS引起NF-κB活化和胰腺腺泡細胞的壞死，炎癥反應和腺泡細胞壞死的持續積累導致胰腺炎持續進展加重[28-29]。使用NF-κB小分子抑制劑可以阻斷ERS，抑制胰腺炎的進展[30]。此外，NF-κB 下游的炎性因子，如腫瘤壞死因子α(TNF-α)亦會導致UPR的活化，表現為XBP1和GRP78的表達增加以及eIF2α的磷酸化[31]。同理，TNF-α、IL-1β和IL-6可引起細胞的ERS，導致cAMP反應元件結合蛋白H的活化[32]。這種機制可能與炎癥遞質干擾蛋白的正常折疊和線粒體的代謝平衡，進而使鈣離子釋放的增加和內質網氧化應激聚集有關，啟動炎癥反應。

4．ERS與胰腺腺泡細胞凋亡：當ERS過于強烈或持續存在時，UPR不足以恢復內質網穩態，引起細胞功能失調并觸發細胞凋亡途徑，以清除有功能缺陷的應激反應細胞，維持整個生物體的穩定。ERS通過調節細胞死亡加重胰腺腺泡細胞的炎性損傷，從而加速了胰腺炎的病理過程[33]。

ERS啟動胰腺細胞凋亡的機制主要包括以下幾種：(1)C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein, CHOP)途徑；(2)凋亡信號調節激酶(apoptosis signal-regulating kinase, ASK)1/c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal Kinase, JNK)途徑；(3)半胱天冬酶-12(caspase-12)途徑；(4)Ca2+通路途徑。其中CHOP途徑是ERS特異性轉錄因子[34-35]。UPR的3條信號轉導通路均可引發CHOP的表達， PERK-eIF2α-ATF4是激活CHOP的主要途徑。高表達的CHOP能抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，引起Bax蛋白從細胞質向線粒體移位，破壞Bax/Bcl-2比例，觸發線粒體凋亡途徑[36]。相反，CHOP基因缺陷小鼠Bcl/Bax比值增高，細胞凋亡明顯減輕[37]；激活的CHOP可以使磷酸化的eIF2α去磷酸化，引起蛋白質合成增加，加重ERS。此外，CHOP還可以通過激活GADD34、激活氧化應激和胞質內鈣超載誘導細胞凋亡[38]。

5．ERS與胰腺酶原顆粒自噬：含有酶原顆粒的自噬空泡(自噬體或自噬溶酶體)在腺泡細胞內大量堆積是AP發病早期的標志性特征，與AP發生和發展緊密關聯。生理性自噬是指胰腺腺泡細胞的酶原顆粒選擇性自噬，是胰腺的一種內源性保護性機制，通過VMP1-USP9x-P62通路介導的泛素自噬途徑實現[39]。但AP時自噬空泡的數量和體積均顯著增大，彼此間互相融合，表明此時的自噬為一種功能障礙的缺陷性自噬，是AP反應過度、異常激活自噬或自噬紊亂的結果。缺陷性自噬無法滿足腺泡細胞對損傷細胞器清除的要求，從而進一步加重胰腺的病理損傷。

ERS是細胞自噬的誘發因素，其介導的細胞自噬主要依賴于UPR和Ca2+信號，連接ERS與自噬的UPR信號通路包括PERK-eIF2α、IRE1-TRAF2-JNK，可通過促進自噬體分隔膜的延伸、自噬囊泡的聚集，上調自噬過程，平衡ERS誘導的內質網膨脹。Ca2+的持續升高主要通過鈣調節蛋白依賴性激酶-β(calmodulin-dependent kinase kinase-β, CaMKK-β)介導的AMPK活化，并最終通過激活TSC1/2復合物來抑制mTORC1的活性，從而促進自噬[40-41]。

胰腺炎的發病機制與自噬小體的積累有關，乙醇誘導的胰腺炎通過激活ERS，作用于UPR的PERK/eIF2α分支，細胞自噬與ERS相互反應，并與蛋白質降解或內質網破壞相關[42-43]。IRE1-XBP1通過調節基因表達對ERS起負反饋調節，以達到維持蛋白折疊和清除錯誤折疊蛋白的作用。IRE1α與TRAF2相互反應，激活JNK表達，引起ERS誘導的自噬，且XBP1已被證實是通過Beclin-1轉錄激活調節自噬，PERK則通過ATF4觸發自噬[44]，可見ERS通過多種機制與自噬密切相關。

AP的發生和發展進程中，胰腺腺泡細胞損傷是一個由多種因素介導的復雜的生物學過程，由于對其機制的認識尚不完全充分和深入，針對該疾病預防和治療的有效策略仍然不足。ERS早期階段，一定程度上UPR可以激活細胞的保護性適應，但持續嚴重存在的ERS，內質網穩態無法恢復，則造成細胞功能惡化，甚至導致細胞損傷和凋亡。深入研究參與胰腺腺泡細胞損傷進展的啟動和惡化因素，尤其是胰腺炎中ERS和UPR的根本的完整的機制是迫切需要的。嘗試從致病機制途徑尋找保護胰腺的有效方法，可能為AP的臨床治療開辟新的治療方法，具有重要的臨床指導價值和現實意義。

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