低溫等離子體調控皮膚角質形成細胞生物學效應的作用與機制

任凱旋 夏育民

19世紀中期，電療法逐漸開始應用于醫學治療中。隨著技術的不斷進步，等離子體以其獨特的療效被廣泛應用于外科手術治療。等離子體最早用于電外科手術治療，通過熱效應使細胞脫水、蛋白變性及組織壞死等原理對組織進行切割、凝固及術中小血管止血。近年來常壓低溫等離子體受到廣泛研究,因其安全性高、離子活性強等優點，在皮膚、腫瘤、耳鼻喉及口腔領域擁有廣泛的應用前景[1]。與目前手術中常用的高溫等離子體不同，低溫等離子體主要應用于殺菌、助基因轉染、細胞分離及促傷口愈合等方面。近年來研究發現，CAP能夠調節細胞活性、增殖、遷移、炎癥反應[2]；并以ROS/RNS 作為介質影響細胞分化、凋亡、細胞結構(如細胞骨架及結締組織)的完整性[3]；抑制腫瘤細胞生長并促進腫瘤細胞凋亡的作用[4]?，F有研究表明CAP能夠調節角質形成細胞的生物學效應，然而CAP的產生機制、具體成分、功能及其作用機理尚不完全清楚，各研究之間沒有明確的統一界定標準，難以比較。因此本文就CAP對皮膚角質形成細胞的生物學效應及作用機制進行綜述。

1 CAP發生機制

CAP的發生機制為基于電介質阻擋放電、以射頻電容耦合的方式在正常大氣壓下產生等離子體，其主要成分為電子、離子、光子、原子、分子、活性自由基及射線等。與高溫平衡等離子體(>80℃)不同,CAP為非平衡等離子體,其特殊的物理性質使其溫度維持在20℃～40℃，其機制為等離子體中電子升溫速度快于其他粒子，而CAP中含有大量質量較大的離子、分子等，雖然局部電子溫度升高但等離子體整體仍保持低溫水平。從發生裝置將CAP分為直接等離子體源、間接等離子體源及混合等離子體源。直接等離子體源以人體作為一端電極，電介質阻擋放電即為此類等離子體源，其直接采用空氣進行激發產生等離子體，并直接作用于處理對象表面；間接等離子體源為由兩個電極產生等離子體后通過噴射裝置傳輸到處理部位，如等離子針、等離子炬等；混合等離子體源綜合了前兩種等離子體源的發生方式，如阻擋電暈放電MiniFlatPlaSter為此類等離子體發生裝置。從激發氣體所產生的等離子體成分可分為空氣、氬氣、氦氣及氮氣與氧氣的混合氣體；以作用于處理對象的方式不同可分為兩類，直接等離子體及間接等離子體，直接等離子體指等離子體流直接接觸處理對象，間接等離子體指等離子體使用等離子體處理后的媒介作用于研究對象發揮效應，如等離子水(PAW)及等離子體處理過的培養基等。

2 CAP治療皮膚疾病

2.1 慢性難愈合傷口 CAP在體外實驗中具有高效的抗原核生物和生物膜作用，在體內實驗中對慢性難愈合傷口也有抗感染作用。Wende等發現CAP作用后傷口細菌負荷量明顯少于未處理組，且傷口愈合程度也明顯優于未處理組[5]。體外實驗中CAP能減少慢性傷口細菌負荷、無任何副作用，而且在處理嚴重傷口時其促進傷口愈合能力明顯強于安慰劑組。CAP能夠激活角質形成細胞通過旁分泌作用釋放血管生成因子作用于血管內皮細胞促進血管生成，同時增加局部ROS/RNS濃度使血液灌注到損傷部位[6]。目前臨床研究已證實CAP處理慢性難愈合傷口2～5 min/d可顯著降低傷口的細菌負荷并促進傷口愈合，MicroPlaSter多用于此類慢性難愈合傷口治療[7]。

2.2 皮膚腫瘤 CAP對腫瘤細胞的作用有劑量依賴性，而且其抗腫瘤效果與腫瘤細胞的生長速度成反比。氧化應激與人皮膚腫瘤的發生發展有著密切連系，與角質形成細胞相關的皮膚腫瘤有基底細胞癌與鱗狀細胞癌兩種。長期紫外線暴露導致的細胞抗氧化能力減弱可能與皮膚癌癥的發生有關。目前皮膚腫瘤方面的研究多為CAP對惡性黑素瘤的治療，Binenbaum等用冷等離子體射流處理黑素瘤細胞及裸鼠種植瘤，體外實驗中CAP處理黑素瘤細胞60 s后，細胞增殖明顯抑制；體內實驗中，CAP處理可抑制黑素瘤細胞侵入表皮層[8]，提示臨床可應用CAP抑制黑素瘤的惡性侵襲性發展。

2.3 銀屑病 在銀屑病模型的體外實驗中，CAP處理后細胞線粒體功能障礙且溶酶體滲出增加，IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α、VEGF及其mRNA表達量均升高，IL-12表達量降低。已知銀屑病患者體內IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α高于正常水平，且VEGF是銀屑病發生發展過程中炎癥和血管生成的關鍵因子。IL-12水平與銀屑病臨床癥狀相關，活化的T細胞通過IL-12和IL-23來放大炎癥反應，因此臨床上常以IL-12作為治療銀屑病的靶點，同時CAP中的UVB臨床上常用于銀屑病皮損治療[9]。Klebes等在銀屑病皮損的臨床研究中采用療法為CAP處理1 min/cm2，每周5次共持續2周，75%患者2周后PASI評分降低，且紅斑及滲出均減少，提示CAP有望成為銀屑病的治療新方法[10]。

除以上幾種疾病外，CAP在延緩衰老[11]、黑素瘤[12]及異位性皮炎[13]的治療中也有著廣泛的應用前景。

3 CAP對角質形成細胞的作用

3.1 CAP影響細胞周期 目前認為CAP對細胞周期的調節主要是通過DNA氧化損傷造成，氧化損傷的DNA單鏈易在堿不穩定位點斷裂導致DNA雙鏈解鏈，并與可能已經存在的DNA斷裂片段形成彗星尾。與UVB導致的DNA損傷不同，CAP處理HaCaT細胞后立刻出現彗星尾結構，處理后4 h內開始降低且在24 h內恢復正常。與UVB照射組相比，細胞內DNA 24 h甚至48 h后DNA損傷仍未能修復，提示UVB導致的DNA損傷不可逆，而CAP處理可激活細胞DNA修復機制，同時達到阻滯細胞周期的效應[14]。CAP處理后的細胞呈劑量依賴性地阻滯在G2/M期，ROS導致的DNA結構損傷被ATM/ATR感知，ATM/ATR激活CHk1/2，導致細胞周期依賴性激酶25阻滯細胞有絲分裂。ATM/ATR也可以通過激活腫瘤抑制蛋白p53誘導細胞凋亡。CAP產生的H2O2作用于G1和G2/M細胞周期檢查點導致細胞周期停滯于G2/M期[15]。CAP處理后p53表達增加、PARP分解，但細胞周期停滯蛋白p21及其mRNA表達含量明顯升高，提示等離子體可通過直接調節基因表達來調控細胞周期[11]。

有研究發現CAP使細胞周期停滯于G2/M檢查點以促使腫瘤細胞凋亡，主要是通過降低細胞周期蛋白B1及細胞周期蛋白依賴性激酶1，上調p53、細胞周期蛋白激酶抑制因子1(p21),升高Bax(Bcl-2-like protein 4)/Bcl-2比值來介導細胞周期停滯導致腫瘤細胞凋亡[16]。CAP可降低癌細胞的遷移能力和細胞活性，研究表明CAP對細胞周期內處于各期的細胞均有影響，未進行細胞有絲分裂的細胞在CAP作用下多停滯于G0/G1或者S期[17]，CAP處理后S期細胞中組蛋白磷酸化的H2AX(γH2AX)含量明顯增多，由于γH2AX是DNA雙鏈斷裂的標志，由此證明CAP主要通過氧化損傷DNA來阻滯細胞周期。

3.2 CAP促進細胞因子分泌 CAP能夠調控3000多條結構蛋白基因表達以及某些炎癥介質的釋放，如生長因子和細胞因子等。Zhong等發現CAP處理后人角質形成細胞中IL-12降低，IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、γ干擾素(IFN-γ)及血管內皮細胞生長因子(VEGF)mRNA表達增多[9]。CAP也能顯著誘導角質形成細胞內青蒿琥酯(Artemin)、EGF、內皮素-1(ET-1)、成纖維細胞生長因子(FGF-2)及uPA的表達。CAP刺激角質形成細胞表達TGF-β1和TGF-β2，TGF-β的功能主要有炎癥趨化、纖維化、血管生成及誘導自身基因表達的作用[18]。在治療傷口過程中，CAP能夠激活角質形成細胞分泌傷口愈合相關分子促進傷口愈合，且通過旁分泌作用釋放血管生成因子作用于血管內皮細胞促進血管生成。

3.3 CAP調節細胞黏附相關蛋白 CAP可通過下調縫隙連接蛋白Cx43(gap junctional protein connexin 43)、鈣黏蛋白E(E-cadherin)、整合蛋白(integrins)來調節細胞間及細胞與基質間的黏附作用。

Cx43分布于角質形成細胞外表面，高表達的Cx43使細胞間連接密切從而抑制細胞遷移和傷口愈合。CAP處理后角質形成細胞中Cx43 mRNA和蛋白的表達均顯著降低，提示CAP可能通過降低角質形成細胞表面的Cx43調節細胞遷移能力，促進傷口愈合[3]。等離子體處理后1 h和24 h后角質形成細胞中Cx43 mRNA和蛋白的表達均顯著降低，提示Cx43的表達降低可能與細胞遷移能力提高有關。提示CAP可能通過降低角質形成細胞表面的Cx43調節細胞遷移能力，促進難愈合傷口愈合。

鈣黏蛋白E是細胞間緊密連接結構的主要連接蛋白，CAP處理細胞60 s后，細胞內鈣黏蛋白E表達量顯著降低。表皮生長因子樣蛋白3(CELR3)與細胞信號轉導和細胞黏附功能有關，并且在表皮細胞間、表皮與間葉組織之間起信息傳遞的作用，CELR3獨特的功能使其可能成為CAP作用的靶蛋白從而調節細胞遷移及生長修復[19]。

CAP還可通過臭氧和過氧化氫調節整合素表達。人角質形成細胞膜主要表達整合素α2和整合素β1，研究發現CAP可以上調細胞膜表面整合素α2表達，當CAP處理時間為5 min時整合素α2、整合素β1、整合素α5、整合素α6、整合素β3均表達增多。慢性難愈合傷口細胞中角質形成細胞表達整合素α5減少導致整合素α5β1受體表達下調，提示CAP可以通過增加傷口部位角質形成細胞內整合素α5的表達促進傷口愈合[20]。

3.4 CAP調節細胞抗氧化相關酶及蛋白 核因子E2相關因子2(NRF2)控制著許多抗氧化通路，CAP處理后人角質形成細胞中NRF2與還原性谷胱甘肽均表達下降。NRF2在編碼抗氧化蛋白、解毒酶的合成及調節內環境氧化還原水平中起到重要的調節作用，谷胱甘肽代謝是NRF2相關信號通路的標志性事件。NRF2能夠感知氧化應激反應并啟動抗氧化程序從而維持細胞內環境穩定。在基礎狀態下，KEAP1保護NRF2不被泛素降解。當細胞內半胱氨酸發生氧化反應時，NRF2從KEAP1上解離，并與細胞核內抗氧化反應相關基因的啟動子結合從而啟動轉錄表達，該基因編碼ROS解毒酶、抗氧化物等蛋白質如谷胱甘肽轉移酶、細胞色素P450、NQO1酶(NADPH-quinone oxidoreductase 1)、血紅素加氧酶1(HMOX1)、γ-谷氨酰半胱氨酸連接酶(GCLC)、谷氨酰半胱氨酸連接酶調節物(GCLM)、超氧化物歧化酶1-3(SOD1-3)、硫氧還蛋白(TRX)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)及非酶類抗氧化物如谷胱甘肽等。BACH1通過其亮氨酸拉鏈與抗氧化相關基因結合從而抑制基因轉錄，雖然CAP對BACH1表達的影響機制并未明確，但是BACH1能夠抑制NRF2介導的血紅素加氧酶1的表達下調[21]?？傊?，CAP主要通過誘導細胞抗氧化作用，通過NRF2/KEAP1信號通路調節細胞抗氧化反應。

3.5 細胞凋亡相關分子 CAP對細胞的凋亡效應主要通過RONS對細胞的形態、能量代謝相關酶及凋亡相關細胞因子的調節發揮生物學效應。CAP處理后細胞內RONS含量升高，許多分子量為42～45KDa的肌動蛋白被氧化，研究表明肌動蛋白的氧化修飾會導致細胞骨架改變并誘導細胞凋亡，從而導致細胞形態的改變。CAP處理后，順烏頭酸酶和α-酮戊二酸脫氫酶(KGDH)均喪失活性，細胞能量供應受到影響從而促進細胞凋亡[4]。線粒體在細胞凋亡過程中起調節作用，CAP作用下多個細胞內外信號導致線粒體內氧化應激作用累積，使線粒體內氧化物更易穿透線粒體膜進入胞漿，并促進促凋亡因子如細胞色素C釋放，該過程主要由Bcl-2蛋白家族調控并啟動酶聯反應[22]。CAP作用使細胞培養基和緩沖液中NO產物如亞硝酸鹽和亞硝基硫醇含量增加，由于亞硝酸鹽和亞硝基硫醇在UVA或藍光的作用下不依賴酶也可以生成NO，因此CAP作用下細胞內NO濃度升高，而NO可通過升高cGMP的濃度調節細胞因子的表達，從而介導細胞凋亡。

3.6 其他相關分子 CAP促進角質形成細胞β防御素表達[23]。防御素是一類富含半胱氨酸的陽離子蛋白，在皮膚炎癥狀態及皮膚損傷部位均能夠發現防御素的表達，其主要功能類似抗菌肽(AMPs)，通過結合在細菌細胞膜上造成膜穿孔，使細胞內重要離子和營養物質外流，從而破壞細菌細胞完整性，起到抵抗細菌、病毒及真菌感染的作用。

4 CAP的安全性研究

有學者對CAP的致突變效應進行研究，CAP處理角質形成細胞2 min后孵育觀察72 h，未見明顯毒性反應發生。連續處理過程中，每24 h CAP處理1～2 min連續處理4次，仍未產生細胞毒性反應。但處理5 min時細胞活力明顯下降，間隔24 h重復處理后并未發現損傷累積作用。與UVC對照組相比，CAP導致的基因突變并不顯著，接近于隨機突變水平[24]。Lademann等對CAP的溫度及其發射的紫外線進行了研究，發現CAP中紫外線劑量并不足以在人皮膚表面引起紅斑效應，而且處理部位未發現CAP導致的熱損傷[25]。因此認為CAP應用于體外培養的細胞尚無基因毒性作用，但CAP的體內作用機制及其副作用仍需進一步研究。

激發氣體種類不同CAP中RONS成分也不盡相同，目前認為以氮氣為激發氣體產生的CAP較以空氣為激發氣體的CAP對細胞的損傷作用更小，安全性更好，添加氮氣后CAP中RNS的含量增多，而添加氧氣后ROS顯著增多。潮濕環境下等離子體中ROS更產生且高濃度的ROS如H2O2易造成組織損傷，75% O2與25% N2混合氣體作為激發氣體時ROS和RNS含量均達到最低且基因表達和蛋白質水平最高。當100% N2或75% N2和25% O2混合氣體作為激發氣體時，產生的ROS和RNS最多，對細胞及組織的損傷作用最強[26]。而目前氬氣作為最常用的激發氣體，其優點如下: (1)在臨床可獲得;(2)化學反應惰性，激發后產生有毒物質少；(3)相較其他氣體如空氣更容易激發。因此相較于氮氣、空氣及其他混合氣體成分而言，氬氣作為惰性氣體激發后產生的有毒物質少，常溫常壓條件下更易被激發，產生的CAP溫度更低從而保證其對組織的熱損傷效應亦最小，因此目前認為最安全的CAP為氬氣來源。

5 結論

綜上所述，低溫等離子體以其獨特的生物學特性擁有廣泛的臨床應用前景。目前盡管有學者提出了數條可能的信號通路，如GP-PKG信號通路、RhoA-ROCK、Nod2-NF-kB信號通路[22]及NRF2/KEAP1信號通路[20]，但確切的CAP蛋白質靶點仍未明確，CAP的作用機制仍需進一步研究。由于多種因素均能影響CAP的生物學效應，如處理時間長度、氣體來源、氣體流速和激發電壓及培養基的成分、體內外實驗差異等，使不同研究結果之間難以進行比較。因此，隨著CAP生物學效應研究的不斷深入，建立標準化的實驗體系亦系迫在眉睫。