牛冷凍精液的質量檢測與管控

馬振華

（甘肅省家畜繁育改良管理站733000）

1 工作準備

（1）檢測標準，牛冷凍精液檢測標準按照GB4143-2008中的技術要求和判定標準[1]，對0.25ml牛冷凍細管精液的容量、有效精子數、精子活力、畸形率、菌落數5項指標進項檢測。檢測嚴格按照“牛冷凍精液質量檢測技術操作規程”完成。

（2）牛細管冷凍精液來源，甘肅省佳源畜牧生物科技有限責任公司庫房隨機批次抽取。檢測牛品種XM、XL、PA。

（3）檢測室環境，室內保持清潔衛生，整齊、安靜、無異味。室內配備控溫、控濕設施，保證工作期間室溫能控制在20～25℃，相對濕度控制在35%～55%。工作時應穿潔凈的工作服、鞋子，戴手套、口罩、帽子等。

（4）儀器設備，檢測儀器設備的數量、性能和精度能滿足檢測工作要求，完好率為100%。玻璃器皿類刷洗干凈消毒、干燥后備用。

（5）耗材試劑類，無論是一次性的還是可重復使用的都必須是無菌、無毒的?；瘜W試劑盡量使用分析純，培養基及染色試劑可選擇商品化的半成品。

2 精液檢測

2.1 劑量

每頭牛隨機抽取3支細管冷凍精液室溫解凍，剪去超聲波封口端，用細管專用推針把精液逐一推入小試管內，用玻璃吸管與撿卵器連接后吸盡小試管內的精液，讀取吸管內精液量值，檢測每劑量細管凍精容量不少于0.18ml。

2.2 精子活力

2.2.1 精液解凍

每頭牛取3支細管冷凍精液置于37℃水浴中解凍40s，解凍后擦干水珠，用專用剪剪去超聲波封口端，細管精液專用推針把精液逐一推入試管內，混勻活力≥35%。

2.2.2 目測法

用移液器取解凍精液約10uL置于載玻片的一端，為第一樣片，同樣方法取精液約10uL置于載玻片的另一端，為第二樣片，分別蓋上蓋玻片立即在顯微鏡（10×40）下觀察精子運動圖像。載物臺溫度應保持在38℃。觀察部位選擇蓋玻片的中部，每個樣片觀察3個以上視野，觀察不同液層內的精子運動狀態，進行全面評定。至少觀察2個樣片，所有觀察樣片的平均值為最終評定結果。

2.2.3 前進運動精子數

精液解凍方法同2.2。用移液器吸取20μL精液注入盛有0.98ml的3.0%氯化鈉溶液的試管內混勻。血球計數板用血蓋片將計數室蓋好，用移液器吸取10μL稀釋精液于血蓋片邊緣，使稀釋精液自行流人計數室，均勻充滿，無氣泡。

2.2.4 精子畸形率

（1）抹片，各牛均取精液1滴，滴于載玻片一端，用另一邊緣光滑的載玻片與有樣品的載玻片呈一定夾角，將樣品均勻地拖布于載玻片上。自然風干5～10min，每樣品制作2個抹片。

（2）固定，在已風干的抹片上滴上1.0～2.0ml中性福爾馬林固定液，固定15min后用清水緩緩沖去固定液，自然風干。

（3）染色：將固定好后的抹片反扣在帶有平槽的有機玻璃面上，把姬姆薩染液滴于槽和抹片之間，讓其充滿平槽并使抹片接觸染液，染色1.5h后用清水緩緩沖去染液，晾干待檢。

（4）鏡檢，將制備好的抹片在顯微鏡(400～600倍)下觀察，每個抹片觀察200個以上的精子（分左、右兩個區），取兩片的平均值。

2.2.5 細菌數在超凈化工作臺內點燃酒精燈，平皿蓋面標記上每個牛的編號，75%酒精棉球擦抹整支細管，細管剪用酒精燈火焰消毒，剪去細管超聲波封口端，用細管推針將整支細管的精液注入平皿內，及時將恒溫53℃的營養瓊脂培養基傾倒入平皿內10～15ml，并轉動平皿使其與精液混合均勻。同時將營養瓊脂培養基傾倒入一沒有精液的滅菌平皿內作空白對照。待瓊脂凝固后，翻轉平板，放置在恒溫培養箱內，37℃培養48h[2]。為保持箱內濕度和防止水分的過分蒸發，可放置一小燒杯水，到達培養時間立即計數。

3 檢測結果

凍精檢測結果見附表。

4 小結

（1）凍精外觀和劑型、劑量檢測結果為100%合格。目前各公牛站均采用精液細管封裝機，只要設備正常使用，不會影響精液質量。檢測精液密度每劑量有效精子數低于800萬個/劑，可通過精子密度測定儀調整[3]。精液處理室空氣采用負壓通風方式，人員著消毒服進入，生產結束后進行全面清洗消毒操作臺面，細管分裝軟管，創造無菌環境可有效降低細菌數。

（2）做好種公牛早期培育與調教工作，嚴格控制體型防止形成草腹、保證公牛營養均衡合理供給，加強運動不少于2h/d，不得粗暴對待公牛，防止套采，避免公牛應激反應，采精場保持安靜，采精器械、場地嚴格消毒，采取適宜的防滑措施，凡是接觸精液的器具都應嚴格清洗消毒。稀釋液現配現用，雞蛋來源于無疫病的雞場，新鮮潔凈，冷藏保存，產后7d后的雞蛋不宜使用。避免夏季、冬季高溫和極寒冷天氣，陰雨雪和異常氣候天氣、種公牛免疫注射后15d，疾病治療期間均應停止生產，影響精液質量和種公牛健康。