魚類抗菌肽研究進展（一）

劉洪巖，薛暉，張世勇，王江，趙沐子，陳校輝，邊文冀

（江蘇省淡水水產研究所，江蘇 南京 210017）

抗菌肽是一類廣泛存在于自然界中的高度保守的多肽，在體外和體內都表現出廣譜抗菌活性?？咕淖钤缭趦蓷珓游镏邪l現，隨后在兔和人類中發現[1]。魚類中發現的最早的抗菌肽是1980年從美洲鰈中發現的，但直到1996年后才有突破性的進展，目前魚類抗菌肽研究已取得與其他脊椎動物物種相同的進展，發現了piscidin家族（魚類特有的抗菌肽，與天蠶抗菌肽同源），以及防御素、cathelicidin、hepcidin家族[2]。魚類的抗菌肽表現出許多與他脊椎動物抗菌肽相同的特點，如廣譜的抗菌活性和免疫調節功能。此外，魚類抗菌肽表現出獨特的適應水生環境和微生物的特異性，因此，類抗菌肽在人類醫學和水產養殖中都具有成為治療劑的潛力。

1 Piscidins

Piscidins是一類線性、兩親性抗菌肽，進化上與兩棲類動物和昆蟲抗菌肽相似[3]。在美洲擬鰈皮膚分泌物中發現的一種25個氨基酸的抗菌肽pleurocidian，是該家族發現的第一個成員。隨后，在其他相關物種中發現與pleurocidins同源的抗菌肽[4]。這些抗菌肽都是兩親性，類似于爪蟾抗菌肽天蠶素。在泥鰍中發現的piscidins被稱為misgurin[5]，在雜交條紋鱸[6]肥大細胞中發現的Piscidins稱為piscidian。其他類似的肽，包括 moronecidin，epinecidin，dicentracin，通過對其成熟肽的二級結構以及基因結構的預測，發現他們都屬于同一個進化相關的家庭，因此將其稱為piscidins。

從氨基酸序列比對來看，piscidins家族有1個保守序列，也就是其雙親性的α-螺旋結構[3]。他們的基因由四個外顯子和3個內含子組成，編碼1個含有1個信號肽肽前體，成熟肽和1個羧基末端結構域[8]。

Piscidins主要在鰓、皮膚和腸表達，在頭腎和脾臟中有少量表達[9]。然而，大西洋鱈魚的軟骨、心臟、卵母細胞、外分泌和內分泌腺體，魚鰾和其他組織中均有表達，不同的部位表達不同的亞型[10]。此外，表達piscidins的主要是存在于不同組織的的肥大細胞，小粒細胞，吞噬細胞和嗜酸性粒細胞[11]。粒細胞的吞噬體可以通過細胞內分泌的piscidins殺傷細菌，這說明Piscidins可以通過參與胞內和胞外的免疫應答來殺傷細菌[10]。此外，比目魚中，piscidins在孵化后13 d開始表達，說明Piscidins在個體發育中起到重要作用[12]。

像哺乳動物的抗菌肽基因一樣，各種刺激，包括革蘭氏陽性和陰性菌，細菌細胞成分LPS[11]或細菌抗原ASAL[9]都會引起魚類抗菌肽基因的表達。LPS介導斑馬魚epinecidin-1基因表達，需要肝細胞核因子1的參與。此外，魚類的piscidins基因表達，可以由寄生蟲、病毒和聚肌胞引起[11]。另一項研究表明，高生物量密度作為一種急性應激方式，會導致上調鰓和皮膚上調表達dicentracin[13]。

Piscidins具有廣譜的抗菌活性，對革蘭氏陽性菌和陰性菌都有殺傷性，對幾種鏈球菌、假單胞菌、芽孢桿菌和弧菌都具有抗性。Piscidins也被證明具有抗真菌活性[6]，抗寄生蟲活性[11-12]和抗病毒活性。研究表明，piscidin-2是能夠有效抑制水霉[8]。

除了微生物，piscidins還具有介導或殺死腫瘤的活性，能夠被piscidins抑制的細胞系包括A549細胞系，HT1080 細胞、U937、HL60、U937、HeLa[14]以及不同乳腺癌細胞系[15]。此外，pleurocidin能夠通過損傷線粒體膜和釋放ROS殺死NOD SCID小鼠乳腺癌移植瘤[22]；piscidins還可以通過破壞癌細胞的細胞膜來殺死癌細胞[14]。

Piscidins通過細胞膜“打孔”的方式導致細胞物質流出，人工膜模型證明，piscidins的膜定位能力，影響其裂解細胞的能力。此外，使用特定的高分辨率的固態NMR和圓二色譜結果表明，piscidin-1和-3誘導的膜與piscidins相互作用發生在模型表面的α-螺旋方向并且是平行面快速的、大幅度的骨干運動[16]。當piscidins濃度低時，不會造成明顯的抑制與細胞膜損傷，但能夠抑制細菌大分子的合成。通過對原生質體再生和細胞膜破壞，造成氧化應激，誘導細胞內活性氧（ROS）釋放，激活metacaspases，導致磷脂酰絲氨酸外翻，從而引起真菌和白色念球菌凋亡[17]。

Piscidins的免疫調節能力是他的另外一個重要特性。在魚類中，它們能夠調節促炎和其他免疫相關基因的表達，如 IL-1β、IL-10、TNF-α、IL-22，IL-26，IFN-γ，NF-κB，溶菌酶，NOS2，MyD88，TLR4a，TLR1、TLR3。還有一些piscidins能夠刺激人體肥大細胞的趨化性增加，Ca2+動員以及誘導促炎性細胞因子（如CCL2，1β/CCL4）的產生，釋放白三烯和前列腺素D2[18]。

總體看來，piscidins是一種進化上非常保守的抗菌肽家族，在魚類中表現出廣泛的同源性，并且在許多其他物種中也有同源抗菌肽種類存在。

2 β-防御素

β-防御素是一類富含半胱氨酸的陽離子抗菌肽，在植物、真菌、無脊椎動物和脊椎動中都有發現，防御素具有保守的半胱氨酸構成的穩定螺旋和β-折疊。在哺乳動物中，根據防御素的結構可以分為三種，α-防御素，β-防御素，和θ防御素[19]。在魚類中，序列分析和結構分析表明，魚類的防御素只有β-防御素樣蛋白[20]，含有保守的6-半胱氨酸結構域。到目前為止，在一個單一物種中發現過多達四個基因，這顯然是在脊椎動物防御素基因復制的結果[22]。人類和魚類的防御素進行進化分析結果表明，人類防御素中僅有HBD-4能夠與魚類防御素聚為一支，因此魚類防御素可能與HBD-4具有相似的生物學特性[20]。

人防御素基因有兩個外顯子和一個內含子，防御素被翻譯后，即為成熟的抗菌肽[21]。在魚類中，防御素基因包含3個外顯子和兩個內含子，編碼的蛋白前體（包括信號肽、前肽和成熟肽），由60到77個氨基酸組成，成熟肽則是由38到45組成的陽離子肽，等電點在8左右（除了牙鲆防御素，等電點是4左右，具有陰離子抗菌肽的性質）。

魚β-防御素已被證明能有效對抗革蘭氏陰性和陽性細菌，但是活性較弱，MIC值比較高。使用β-防御素轉染過的HEK293T細胞的裂解液，能夠顯著提高泥鰍或金頭鯛防御嗜水氣單胞菌和枯草桿菌的能力[23]。β-防御素對特定的病毒，如新加坡石斑魚虹彩病毒，病毒性神經壞死病毒，出血性敗血癥病毒均表現出殺傷活性。有研究表明，人類-防御素-1（HD-1）是能夠使鮭魚彈狀病毒失活[24]。

除了其抗菌活性，防御素還具有多種免疫調節活性。例如，金頭鯛防御素具有趨化活性，能夠趨化斑馬魚頭腎白細胞，其作用機制可能是斑馬魚中有CCR6同源基因[25]。另外，大西洋鱈魚防御素能夠刺激吞噬細胞抗菌活性[26]。

只有少數防御素（主要是HBD-1及其同系物）是組成型表達的，大多數防御素表達是后天的，其表達可由多種因素引起的，其中包括許多先天免疫介質和病原相關分子模式[27-29]。魚β-防御素基因通過各種刺激因子誘導表達，包括細菌細胞壁成分脂多糖，β-葡聚糖和肽聚糖。此外，作為飼料添加劑硅藻naviluca sp.和乳酸菌Lactobacillus sakei能夠誘導的金頭鯛β-防御素表達[30]。綜上所述，魚類防御素是哺乳動物同源的、具有類似結構和功能以及表達方式的多肽。這進一步證明了β-防御素是一個高度保守的、古老的宿主防御機制。