向日葵抗列當水平室內鑒定體系準確性評價及不同品種抗列當水平鑒定

石勝華 柳惠卿 云曉鵬 張鍵 趙君 閆潔

摘要：向日葵列當是一種寄生在向日葵根部的寄生性種子植物。向日葵被列當寄生后表現為植株矮化、花盤減小、產量急劇下降，含油量和蛋白含量也明顯降低，嚴重時可導致向日葵絕收。利用12份在田間條件下鑒定出抗性水平的向日葵品種對室內建立的列當寄生體系（培養皿濾紙體系）鑒定結果的準確性進行了評價。在此基礎上對供試的80份不同向日葵品種的抗列當水平進行了室內鑒定。結果表明，供試的47份食葵品種中以TP3313為代表的3份品種表現為免疫水平，所占比例為6%;而以JK601為代表的11份品種呈現高抗水平，占比為24%;其余品種均呈現感病和高感水平。供試的33份油葵品種中以F917為代表的11份品種表現為免疫水平，所占比例為33%;而以赤CY102為代表的14份品種呈現高抗水平，占比為43%;感病和高感水平品種占比為3%。整體看來，油葵品種對列當的抗性水平顯著高于食葵品種。

關鍵詞：向日葵;列當;品種抗性鑒定;抗性鑒定標準

中圖分類號：S565.5;S451文獻標志碼：A文章編號：1003-935X（2019）02-0028-07

Accuracy?Evaluation?of?Appraisal?System?for?Indoor?Resistance

Level?of?Sunflower?against?Broomrape?and?Resistance?Identification?of

Different?Sunflower?Varieties?against?Broomrape

SHI?Shenghua1，LIU?Huiqin1，YUN?Xiaopeng2，ZHANG?Jian1，ZHAO?Jun1，YAN?Jie3

（1.College?of?Agriculture?，Inner?Mongolia?Agricultural?University，Hohhot?010019?China;

2.?Plant?Protection?Institute，Inner?Mongolia?Academy?of?Agriculture?and?Animal?Husbandry?Sciences，Huhhot?010031，China;

3.?College?of?Grassland，Resources?and?Environment，Inner?Mongolia?Agricultural?University，Hohhot?010019?China）

收稿日期：2018-12-19

基金項目：國家特有油料產業技術體系建設專項（編號：CARS-14）;內蒙古自治區科技計劃“向日葵列當抗性種質資源創新及關鍵防控技術研究與集成示范”;內蒙古自治區科技計劃“向日葵黃萎病抗性種質資源創新及新品種選育”;內蒙古自治區科技重大專項“向日葵高產高效綜合技術與產業化”。

作者簡介：石勝華（1992—），女，內蒙古巴彥淖爾人，碩士研究生，主要從事向日葵列當研究。E-mail：1032064290@qq.com。

通信作者：趙?君，教授，從事分子植物病理學研究，E-mail：zhaojun02@hotmail.com;閆?潔，高級實驗師，從事植物學植物分類研究，E-mail：13634717552@163.com。

Abstract：Sunflower?broomrape?parasitizes?the?roots?of?sunflowers?causing??dwarfness，loss?of?yield，and?dramatic?reductions?of?oil?and?protein?content.?In?this?study，the?resistance?level?of?12?sunflower?varieties?was?assessed?by?counting?parasite?tubercles?in?a?standard?Petri?dish?filter?paper?system.?Results?were?consistent?with?those?obtained?in?previous?field?studies，indicating?that?the?petri?dish?bioassay?could?be?regarded?as?a?comprehensive?evaluating?system?for?sunflower?resistance?identification.

Eighty?sunflower?varieties?were?tested?for?broomrape?resistance.?Three?varieties?represented?by?TP3313?in?the?47?edible?sunflower?varieties?tested?were?inmune，accounting?for?6%;?while?11?varieties?represented?by?JK601?were?highly?resistant?（accounting?for?24%）;?the?rest?of?the?varieties?were?susceptible?or?high?susceptible.?Among?the?33?oil?sunflower?varieties?tested，11?（33%）?varieties?represented?by?F917?were?immune?while?14?varieties?represented?by?red?CY102?（43%）?were?highly?resistant.?The?proportion?of?susceptible?and?highly-sensitivity?varieties?was?3%.?Overall，the?resistance?of?the?oil?sunflower?varieties?to?the?Leydang?was?significantly?higher?than?that?of?the?sunflower?varieties.

Key?words：sunflower;broomrape;resistance?identification?of?sunflowers;resistance?identification?criterion

向日葵列當屬于全寄生、根寄生的寄生性種子植物，其生長所需的全部水分和營養物質均須要從寄主的根部吸收[1]。向日葵被列當寄生后，植株生長緩慢，矮化、黃化、萎蔫或枯死，從而造成產量和品質降低，嚴重時可導致農作物絕收[2]。

列當屬植物首次于1951年在塞爾維亞被發現，隨后在羅馬尼亞、保加利亞、土耳其、西班牙、俄羅斯等國家都相繼報道了新的列當屬植物的出現[3-5]。我國自1959?年在黑龍江省肇州縣發現向日葵列當以來[6]，隨著向日葵大面積的連作、引種的混亂、管理粗放，導致列當在全國各向日葵種植地的發生和危害呈逐年加重的態勢。向日葵列當在田間發生危害較輕的1株向日葵上平均寄生12株列當，寄生率為46%;危害較重的能夠寄生?30～50株，最多高達143株，寄生率為81%[1，7]。2006?年列當在巴彥淖爾市的向日葵地塊中僅零星發生，而到2014年該市40%向日葵地塊都有列當的發生，平均寄生率為70%以上，造成向日葵產量損失25%～40%。因此，向日葵列當是繼向日葵菌核病之后又一限制我國向日葵產業發展的主要因素[6]。

目前，國際上采用的防控向日葵列當的措施主要有種植免疫或高抗列當的向日葵品種、種植誘捕植物、利用生防菌劑進行土壤處理，以及噴灑除草劑等，其中種植免疫或高抗向日葵品種仍然是最為有效的、綠色的向日葵列當的防控措施。因此，室內條件下建立向日葵抗列當水平的快速鑒定體系，以及利用該體系準確地鑒定向日葵育種材料的抗列當水平將為向日葵抗列當育種奠定堅實的基礎[8]。

1?材料和方法

1.1?材料

供試的材料為國家特色油料產業體系向日葵育種崗位和試驗站提供的向日葵品種、品系或育種材料（以下都簡稱為材料），共計80份，其中食葵47份、油葵33份，供試材料的相關信息見表1。供試的向日葵列當的種子采自巴彥淖爾市烏拉特前旗西小召鎮進行田間向日葵列當水平鑒定的地塊，生理小種鑒定為G小種。

1.2?試驗方法

1.2.1?田間試驗方法

1.2.1.1?田間設計?試驗采用隨機區組設計設置，每個品種的小區面積為13?m2，每個品種設置3次重復，試驗組內的材料隨機排列。

1.2.1.2?田間管理?將供試的向日葵品種在2017年6月5日進行人工播種，采用大小行種植，大行?100?cm，小行40?cm，株距40?cm，2?200株/667?m2。當向日葵長到V6～V8期（6～8張真葉）進行中耕除草。

1.2.1.3?田間調查?在向日葵成熟期調查試驗小區內向日葵的株數以及列當的寄生數量，利用下列的公式計算列當的寄生率、寄生程度[9]?。

寄生率F=（列當寄生的向日葵株數/小區內調查的總株數）×100%;

寄生程度（AD）=小區內寄生列當的總數/小區內向日葵總株數。

1.2.2?向日葵抗列當水平的室內鑒定（培養皿濾紙法）

1.2.2.1?向日葵列當種子的清潔和表面消毒?將田間采集的向日葵列當種子過篩網（直徑為0.18?mm）去除雜質后置于1.5?mL離心管中，然后加入1?mL蒸餾水進行振蕩清洗。12?000?r/min離心10?min后棄上清液加入1?mL?0.1%次氯酸鈉溶液充分振蕩后靜置5?min，離心（12?000?r/min）?10?min?后棄上清液;然后向離心管沉淀物中加入?1?mL?75%乙醇，振蕩后靜置5?min;離心（12?000?r/min）?10?min后棄上清液，然后加入無菌水沖洗3次。將清洗后的列當種子平鋪于濾紙上進行干燥，用毛筆收集干燥后的種子置于?1.5?mL?離心管中備用。

1.2.2.2?向日葵種子的催芽?挑取顆粒飽滿的向日葵種子放入盛有150?mL?75%乙醇的錐形瓶中，充分振蕩后靜置5?min;然后將乙醇倒出，加入無菌水振蕩沖洗2次，取出消毒后的向日葵種子用于萌發。

將脫脂棉均勻地鋪于玻璃皿中（約3?mm厚度），然后用無菌水將脫脂棉潤濕。將消毒后的向日葵種子用紗布包裹置于脫脂棉上，然后在培養皿上蓋1塊濕潤的毛巾，將培養皿置于25?℃恒溫培養箱中培養，促進種子萌發。在催芽期間每天向培養皿內澆水1次，以保持脫脂棉和紗布濕潤，出芽后的向日葵種子用于后續向日葵根系分泌物的搜集。

1.2.2.3?向日葵根系分泌物收集?將砂石用清水反復沖洗后放入鋁盒中進行高溫滅菌。將滅菌后的砂石放入250?mL的廣口瓶中（約2/3體積），然后將催芽后的向日葵接種于廣口瓶中，用脫脂棉固定向日葵根系，每瓶接種5株向日葵，用錫箔紙包裹廣口瓶置于25?℃恒溫培養箱培養48?h后收集向日葵根系分泌物。將向日葵根系分泌物分裝于50?mL離心管并放入-4?℃下保存。

1.2.2.4?向日葵列當種子的預處理?在直徑?9?cm?的玻璃皿底部鋪上滅菌的濾紙，用收集好的向日葵根系分泌物將濾紙潤濕后，將經過消毒處理的向日葵列當種子均勻地平鋪在濾紙上，用封口膜封好培養皿，置于23～28?℃黑暗條件下進行預處理，10?d后便可用于接種處理。

1.2.2.5?接種向日葵列當種子?將脫脂棉均勻地平鋪于12?cm×12?cm的塑料培養皿底部（厚約3?mm），脫脂棉上方覆蓋1層與培養皿等大的濾紙。然后將1?mg經過預處理后的列當種子均勻地置于濾紙的1/3～2/3處，然后用蒸餾水將脫脂棉與濾紙潤濕。將事先催芽的向日葵幼苗接種到培養皿（2株/皿）中，幼苗的根系置于潤濕的濾紙上，并且用少量的濕潤的脫脂棉固定向日葵的根系。蓋上皿蓋后用錫箔紙包裹培養皿（對向日葵根系進行避光處理），將培養皿直立豎放到光照培養箱中（白天25?℃，光照度66%;夜晚18?℃，黑暗;相對濕度為50%）。每隔1?d向皿內加蒸餾水1次，1周后可進行觀察。

1.2.2.6?向日葵列當種子萌發率、寄生瘤結數及出莖數的觀察和統計?接種1周后在體視顯微鏡下觀察向日葵列當種子的萌發情況，隨機選擇100粒向日葵列當種子進行觀察，分別統計接種?7?d?后列當種子的萌發率和在接種30?d后寄生的瘤結數。

1.2.2.7?田間條件和培養皿濾紙體系下向日葵抗列當水平的鑒定標準?鑒定標準分別見表2和表3。

2?結果與分析

2.1?向日葵品種抗列當水平的田間鑒定

田間向日葵抗性的結果（表4）表明，12份向日葵品種被劃分為5個抗性等級。其中，免疫列當品種有1份，即TP3313;高抗列當品種有3份，包括JK601、JK103、巴葵138;中抗列當品種有2份，為科陽1號、科陽7號;中感列當品種有5份，以JK108、甘葵2號等為代表;高感列當品種有1份，即LD5009。

2.2?評價室內培養皿濾紙體系鑒定向日葵抗列當水平的準確性

室內條件下，利用培養皿濾紙體系對12份田間鑒定出抗性水平的向日葵品種根系寄生的瘤節數進行統計，結果（表5）發現，在田間條件下呈現免疫的品種TP3313，在培養皿體系中寄生瘤結數為0，為免疫品種;而田間表現為高抗列當的品種如JK601、JK103、巴葵138等品種在室內體系中寄生的瘤節數均介于1～5個之間，按照培養皿濾紙體系鑒定標準也鑒定為高抗品種;而田間呈現中抗水平的品種如科陽1號、科陽7號等每皿寄生的瘤節數介于6～10個之間，表現為中抗水平。田間呈現中感的品種如甘葵2號、T33?等每皿寄生的瘤節數介于11～15個之間，呈現出感病水平;而田間呈現高感列當的向日葵品種LD5009每皿寄生瘤節數高于15個，也表現為高感。只有JK105和JK108在田間表型為中感，但在實驗室體系下表現為中抗水平（圖2）?；谏鲜鎏镩g和室內條件下抗性鑒定的比較結果，筆者認為可以利用培養皿濾紙體系來評價不同向日葵品種的抗列當水平。

2.3?室內條件下評價不同向日葵品種的抗列當水平的鑒定

2.3.1?食葵品種室內抗列當水平的鑒定?利用室內培養皿濾紙體系對47份食葵品種列當種子的萌芽率、瘤節數進行統計，結果如圖1所示。列當種子在供試的47份品種根系附近的萌發率介于52%～82%之間，品種間存在顯著差異，然而列當種子的萌發率和向日葵的抗性水平沒有顯著的相關性，如免疫品種TP3313的列當種子萌芽率為74%，而感列當品種LD5009的列當種子萌芽率為71%，抗列當品種LX961的列當種子萌芽率為82%。通過統計根部寄生的列當瘤節數發現，不同品種間存在顯著的差異。利用室內培養皿濾紙體系抗性鑒定標準，將沒有瘤節寄生的TP3313、同輝15號、同輝31號鑒定為免疫列當的品種;而JK103、S05-2AX、JK601、JK109、巴葵138等11份品種寄生的瘤節數介1～5個之間，鑒定為高抗水平;鑒定為中抗列當的品種共有15份，包括JK105、LSK17、科陽1號、科陽7號等;易感列當的品種有11份，包括赤葵6003、甘葵2號、科陽4號等;鑒定為高感列當的向日葵品種有7份，以寧食葵1號、LD5009、LX336等為代表?（圖1）。

2.3.2?油葵品種室內抗列當水平的鑒定?供試的33份油葵品種的列當種子萌發率和瘤節數的統計結果如圖2所示。和食葵品種一樣，列當種子在油葵品種根系附近的萌芽率介于53%～85%之間，品種之間存在顯著差異，但和品種的抗性水平沒有顯著的相關性，如免疫品種F917的列當種子萌芽率為77%，感列當品種vt11的列當種子萌芽率為72%，抗列當品種矮大頭的列當種子萌芽率為72%。同樣，按照室內列當抗性評價的標準，將法國1、F917、赤CY106等11份品種鑒定為免疫;將赤CY102、S67、新葵雜5號等14份品種鑒定為高抗水平;而呈現中抗列當水平的品種有7份，以F53、赤KY11-52、赤CY101等為代表;易感列當的品種只有1份，即vt11，寄生瘤節數為13個;沒有鑒定出高感列當的品種。

2.3.3?向日葵食葵和油葵品種抗列當水平的比較?對油葵品種和食葵品種的抗列當水平進行比較，結果（圖3）表明，14個免疫列當品種中，油葵品種為11個，食葵品種僅有3個;25個高抗列當品種中油葵品種占14個，食葵品種有11個;22個中抗列當品種，油葵品種占7個，15個為食葵品種12個易感列當品種，油葵品種只有1個;7個高感列當品種都為食葵品種。整體看來，油葵品種對列當的抗性水平高于食葵品種。

3?結論與討論

本研究將田間試驗已經鑒定出抗性水平的12個向日葵品種作為材料，對筆者所在課題組建立的室內培養皿濾紙體系的抗性鑒定水平的準確性進行評價，結果表明，在室內培養皿濾紙體系下，供試的12份品種中僅有2份品種抗性水平和田間鑒定水平有一定的出入，其余10份品種在室內條件下鑒定出的抗列當水平和田間鑒定的結果完全一致，表明利用室內體系能夠準確且快速地鑒定向日葵的抗列當水平。這是國內外首次利用培養皿濾紙體系對向日葵品種的抗列當水平進行評價。

利用培養皿濾紙體系進行抗性評價過程中，在顯微鏡下同時觀察列當種子在不同向日葵品種根系附近的萌發率，結果表明，列當種子的萌芽率和向日葵品種的抗列當水平沒有顯著的相關性，表明不同抗性水平的向日葵品種對列當種子萌發率沒有影響。然而，利用列當在向日葵根系寄生的瘤節數能夠準確地評價向日葵的抗列當水平，這一結果和石必顯等的室內鑒定方法[10]相一致。因此，在今后抗列當育種過程中建議利用列寄生的瘤節數而不是列當種子的萌發率來評價向日葵育種材料的抗列當水平。

利用筆者所在實驗室建立的室內培養皿濾紙體系對向日葵抗列當水平進行評價，共篩選出免疫列當品種14個，高抗列當品種25個。在免疫和高抗列當品種中，油葵品種所占的比例為64%，遠遠高出食葵品種。這一結果與王文軍等田間鑒定出的向日葵抗列當水平的結果[10-11]高度一致，即列當抗源普遍存在于油葵材料中，食葵材料中抗列當的基因相對較少。同時，石必顯的田間抗性鑒定結果也表明，油葵品種的抗性比食葵高[12]，和本研究室內鑒定出的結果有一定的一致性。王鵬東等在篩選向日葵抗列當育種資源時發現，食葵普遍表現出高感列當水平的結果[9，13-14]也和本研究的結果相一致。上述的鑒定結果將為后續在向日葵生產中合理布局不同抗性水平的抗列當品種以及向日葵抗列當育種具有非常重要的指導意義。

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