CTX-M型超廣譜β-內酰胺酶研究進展

劉保光，栗俞程，汪保英，白 明，苗明三，許二平

(1.河南中醫藥大學 科研實驗中心，河南 鄭州 450046；2.河南省仲景方藥現代研究重點實驗室，河南 鄭州 450046)

近年來，隨著獸用抗菌藥的廣泛應用，細菌耐藥問題變得日趨嚴峻，已成為全球性難以解決的問題。超廣譜β-內酰胺酶(ESBLs)能夠水解含β-內酰胺環類的抗生素，可被β-內酰胺酶抑制劑抑制，其自身大多由質粒介導，同時是革蘭氏陰性菌對β-內酰胺類抗生素耐藥最主要的機制，具有廣泛的水解酶活性[1]。產ESBLs的臨床菌株，不僅對β-內酰胺環類藥物耐藥，而且還對氨基糖苷類、氟喹諾酮類藥物、多西環素、氟苯尼考等耐藥[2]，表現出多重耐藥特性。

CTX-M型ESBLs是一類對頭孢噻肟具有強大水解能力的酶。前人研究發現，CTX-M型ESBLs耐藥基因可以通過質粒、整合子、轉座子等可移動元件，在質粒與染色體間，或從一個質粒到另一個質粒，或從一種細菌到另一種細菌進行轉移，具有復雜的遺傳傳播背景[3-5]。為此，針對近些年有關CTX-M型ESBLs的研究進展進行了綜述，以期為CTX-M型ESBLs菌株感染的防控和遺傳背景的深入研究提供參考。

1 CTX-M型ESBLs的發現

BAUERNFEIND等[6]于1989年首次發現了耐頭孢噻肟的1株大腸桿菌分離菌株(命名為CTX-M-1)。隨后，阿根廷學者于1990年從1株耐頭孢噻肟的沙門氏菌中檢測到CTX-M-2型ESBLs[7]，CNIADKOWSKI等[8]在腸桿菌科細菌中發現了CTX-M-3型ESBLs。相繼檢出CTX-M型ESBLs感染菌株，使CTX-M型ESBLs菌株在眾多國家、地區的各種臨床菌株中得以流行，引起了人們對該型酶的很大關注，并迅速組成了一個穩定增長的ESBLs成員[9-10]。

2 CTX-M型ESBLs的種類

目前，已發現的CTX-M型ESBLs已達上百余種(http://www.lahey.org/studies)，呈現出快速增長的趨勢。而CTX-M型ESBLs的攜帶菌，主要是變形桿菌、大腸桿菌、肺炎克雷伯菌等革蘭氏陰性細菌，臨床發現CTX-M型ESBLs對頭孢噻肟具有較強的水解活性。依據基因同源性的不同，將CTX-M型酶分組 ：①CTX-M-1系列，包含12種酶；②CTX-M-2系列，包含8種酶；③CTX-M-8系列，僅包括這1種酶；④CTX-M-9系列，共11種酶；⑤CTX-M-25系列，包括CTX-M-25和CTX-M-26這2種酶[11]。

3 CTX-M型ESBLs的生化特性與產耐藥性

CTX-M型ESBLs最主要的特征表現在大多數的CTX-M型ESBLs菌株對頭孢噻肟的水解能力遠高于對頭孢他啶的水解能力。頭孢他啶對產CTX-M型ESBLs菌株的最小中抑菌濃度(MIC)介于0.5～2.0 μg/mL，而頭孢噻肟的MIC介于8～256 μg/mL[12]?？梢?，針對產CTX-M型ESBLs菌株，頭孢噻肟的水解率較頭孢他啶高出很多。因此，通過檢測頭孢他啶水解活性的高低，可以初步判斷出大多數CTX-M型ESBLs與TEM、SHV型的不同，以此進行初步分型。

此外，CTX-M型ESBLs的菌株對β-內酰胺酶抑制劑是敏感的。在臨床試驗中，針對大多數產TEM、SHV型ESBLs菌株，舒巴坦的抑制活性沒有克拉維酸強。分析其原因，這主要在于Arg-244位點能較好地與克拉維酸結合，該位點是TEM和SHV型ESBLs的重要位點。CTX-M型ESBLs菌株的Arg-276位點與Arg-244位點的結構有一定的差異[13]，這在一定程度上決定了β-內酰胺酶抑制劑發揮作用的差異。

氨基酸Asn-104-Glu突變后，CTX-M-14型酶對頭孢噻肟的水解能力大大降低，而對第一、二代頭孢類藥物的水解能力影響不明顯[14]。此外，根據已上傳的蛋白質序列發現，在CTX-M型ESBLs菌株中普遍存在Ser237位點，由此可見，Ser237位點在影響產CTX-M型ESBLs菌株的水解活性方面發揮了重要的作用。BOYD等[15]研究表明，CTX-M型ESBLs第167、240位的氨基酸位點，與頭孢他啶的水解活性能力有密切關系，這2個氨基酸位點能夠促進CTX-M型ESBLs與頭孢他啶的結合，使頭孢他啶的水解活性高于頭孢噻肟。

4 CTX-M型ESBLs的流行病學

大腸桿菌和肺炎克雷伯菌是產CTX-M型ESBLs菌株中最常見的細菌。自CTX-M-1型ESBLs首次報道以來，現今許多國家已發現產CTX-M型ESBLs菌株。在產ESBLs的腸桿菌科細菌中，CTX-M-2和CTX-M-3型ESBLs菌株占了重要比例[16]。在不同的國家和地區，攜帶ESBLs菌株的分離率及基因亞型種類也有較大差異，CTX-M-15型在印度、尼日利亞多見[17]，而CTX-M-9和CTX-M-14型在西班牙多見，我國臺灣地區主要以CTX-M-3、CTX-M-14型為常見基因亞型[18-19]。

杜向黨等[20]發現，河南地區雞、豬源大腸桿菌CTX-M型ESBLs的產生率較高, 以CTX-M-2型和CTX-M-9型為主。近年來，我國的浙江、北京、廣州等地區的流行菌株主要以產CTX-M型ESBLs菌株為主，多數同時與產TEM型廣譜酶共存。在檢測的30株虎源大腸桿菌中，產ESBLs的菌株有21株，陽性率高達70%，而CTX-M型基因的檢出率為50%[21]。趙鳳菊等[22]研究發現，遼寧地區的產ESBLs豬源大腸桿菌的檢出率較高，TEM型和TEM+CTX-M型為主要流行的基因型?？梢?，各地產CTX-M型ESBLs的菌株存在一定差異。

5 CTX-M型ESBLs基因可在質粒間、質粒和染色體之間轉移

CTX-M型ESBLs編碼基因通常位于質粒上，大多情況下與TEM-1共同存在于1個質粒上。此外，TEM-2、SHV及OXA-1型的基因還可能存在這個質粒上，質粒的大小介于在7～160 kb，這提示了這些質?？蓴y帶多個或多類耐藥基因[23]。體外試驗發現，CTX-M型ESBLs的質粒通?？赏ㄟ^接合傳遞的方式傳播，這可能是CTX-M型ESBLs菌株容易傳播流行的原因。從產CTX-M-17型菌株中提取的質粒較小，在10 kb以下，不具有接合基因的功能，為非接合型質粒[24]。然而，這種較小的非自我傳播的特殊質粒，也可以進行傳播，它主要是通過轉化的形式來實現。在波蘭腸桿菌科的7種不同細菌中均發現了具有相同耐藥性的CTX-M-3型的質粒[25]。

PALUCHA等[26]從臨床分離的大腸桿菌中發現存在第二染色體插入的CTX-M型基因。在波蘭華沙檢測出2種性質截然不同的質粒上都攜帶CTX-M-3型基因[27]。我國在大腸桿菌和陰溝腸桿菌的質粒和染色體上同時檢出CTX-M型ESBLs基因[28]?？梢?，CTX-M型基因能夠移動，且移動能力很強，可使CTX-M型基因能夠在質粒與質粒間及質粒和染色體間進行互相傳遞，從而達到快速散播的目的。

6 CTX-M型ESBLs的轉位因子及基因轉移的遺傳環境

臨床中攜帶的絕大部分CTX-M型ESBLs基因，主要是由可接合的能夠轉移的質粒所攜帶的，與之相關的轉位因子，如插入序列ISEcp1、IS903、轉座子及整合子等，目前還不明確。一些攜帶有ESBLs基因亞型(如CTX-M-2、CTX-M-3、CTX-M-9、CTX-M-15型等)的基因能夠定位在轉座子、整合子等可轉移的元件上[29]。此外，位于CTX-M型基因上游的ISEcp1移動元件對耐藥基因的傳播發揮了重要的作用[30]。

6.1 ISEcp1、IS903插入序列

SINGH等[31]研究發現，產CTX-M型ESBLs基因的轉移和表達與插入序列的性質有密切的關系。ECKERT等[32]研究發現，在大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、沙門氏菌等多種細菌中發現了ISEcp1插入序列，屬于IS1380成員。CASELLA等[33]發現，插入序列ISEcp1在CTX-M型ESBLs基因的上游較為常見，CTX-M-14型基因的上游都存在ISEcp1，而其他CTX-M型的基因上游也大多存在ISEcp1。FERNANDEZ等[34]研究發現，ISEcp1序列常常位于CTX-M基因的上游，在特定情況下，可以提供CTX-M表達所需要的啟動子。LARTIGUE等[35]研究發現，插入序列ISEcp1可以重復出現在攜帶CTX-M-l、2、3、9、13、14、15、17、19、21型基因上游的42～266 bp位置。其后發現CTX-M-14型和CTX-M-1型5的上游存在ISEcp1，同時發現在CTX-M-15型基因的下游也存在ISEcp1序列，這就闡釋了CTX-M型基因的移動是一個較為復雜的過程[36]。

此外，DIESTRA等[37]發現，產CTX-M-14型基因的上游和下游分別存在插入序列ISEcp1和IS903，這與HU等[38]報道的CTX-M-14型基因的上下游分別出現插入序列ISEcp1、IS903相吻合。LARTIGUE等[39]發現，產CTX-M-14型基因的上游和下游也分別出現插入序列ISEcp1和IS903?？梢?，2個序列在CTX-M-14型基因的傳播中具有重要的作用，能夠使之進行大量傳播，這揭示了CTX-M型ESBLs基因在腸桿菌科細菌中能夠廣泛傳播。

ISEcp1插入序列，又稱為轉座單元，它是CTX-M型基因的重要傳播載體。JIANG等[40]研究發現，常見的轉座單元ISEcp1-CTX-M-IS903-iroN，IS903和iroN在CTX-M型基因的下游。LIU等[41]研究發現，ISEcp1轉座單元中CTX-M型基因的表達水平與ISEcp1中的啟動子(P1)有密切的關系。WANG等[42]研究發現，只有79、80、127 bp間距的單元具有P2活性。把二者進行對比，P1活性較強，它在促進下游基因的表達中占主導地位[43]。

6.2 整合子

整合子廣泛存在于革蘭氏陰性菌中。大多Ⅰ、Ⅱ類整合子與耐藥有關[44]。SABATE等[45]研究發現，在Ⅰ類整合子(如InS21，In35和In60)中發現了產CTX-M-9和CTX-M-2型的基因。這些整合子，結構上包含有5′CS和部分或全部3′CS的副本。而對于整合子InS21，產CTX-M-2型的基因位于ORF513的下游，且在3′端保守序列內，它是一種非尋常整合子[46]。而對于In60，產CTX-M-9型的基因也位于ORF513的下游，也屬非尋常整合子。

6.3 轉座子

轉座子是一個能夠復制、移動的單元，存在于染色體DNA上，包含簡單式和復合式。一般來說，簡單轉座子就是插入序列；而復合式轉座予是一類帶有某些特殊功能基因(如腸毒素基因、耐藥基因、結構基因等)的轉座子。在臨床試驗中，大部分CTX-M型基因是由轉座子來調控的，這就加劇了細菌耐藥性的傳播[47]。耐藥質粒是導致細菌產生耐藥性的一個至關重要的因素，而質粒上的耐藥基因，可通過耐藥質粒的轉化、接合等方式進行水平傳播，在一定程度上加劇了細菌耐藥性。馬帥等[48]研究發現，產ESBLs菌株的同一質?？梢詳y帶多種耐藥基因，這些質?？山閷Ь甑亩嘀啬退幪匦?，分離株的耐藥性與耐藥質粒的轉移密切相關。

7 CTX-M型ESBLs的基因突變

7.1 CTX-M型ESBLs的殘基

細菌攜帶的CTX-M型ESBLs基因在發生不斷的突變，就是為了適應更多更新的抗菌藥物。一些常見的殘基如下。

殘基77：第77位殘基發生了A77→V的變化，雖然位于活性中心的遠端，也能夠對產CTX-M型β-內酰胺酶起到一定的催化作用，具有一定的溫度耐受性。如CTX-M-55型在CTX-M-15基礎上發生了A77→V突變，結果就表現出了對溫度變化有一定的耐受性[49]。

殘基109：經T109→A突變導致的，細菌攜帶的CTX-M-14型基因在109位的氨基酸是丙氨酸(Ala)，而CTX-M-140型是由CTX-M-14型突變而來，研究發現，109位的丙氨酸(Ala)對含CTX-M-14型基因水解頭孢菌素起到了非常重要的作用[50]。

殘基169：第169位殘基位于A類β-內酰胺酶上，與酶對羧基、氨基、青霉素、頭孢他啶的作用有很大的關系。

殘基237和276：研究人員用點突變技術發現，突變后細菌對頭孢噻肟的水解作用減弱。因此，推測Ser237和Arg276殘基對頭孢噻肟的水解作用具有特殊的增強作用[51]。

殘基240：第240堿基主要是發生了D240→G突變。

7.2 產CTX-M型ESBLs的嵌合突變體

最近幾年來，因相互發生嵌合作用出現了一些新的突變體，如CTX-M-14型和CTX-M-15型的嵌合體CTX-M-64型、CTX-M-123型、CTX-M-132型和CTX-M-137型是在CTX-M-14型和CTX-M-15型的基礎上發生突變的。而在CTX-M-123型基礎上，通過若干個堿基突變或替換，這就衍變成了CTX-M-64型β-內酰胺酶，但它對頭孢類藥物的作用強于CTX-M-123型。與CTX-M-14型相比，而CTX-M-64型對頭孢類藥物的水解能力較強，同時也對酶抑制劑如克拉維酸、舒巴坦卻表現出了一定的增加作用[52]。此外，CTX-M-14型和CTX-M-15型的嵌合體還有CTX-M-137型[53]。

8 CTX-M型ESBLs菌株的流行原因及治療措施

CTX-M型ESBLs的流行傳播機制，主要包含水平傳播和垂直傳播兩種形式。而水平傳播主要是針對耐藥基因來說的，通常是耐藥基因在質粒、轉座子、噬菌體、整合子等相關可移動元件的協助下來完成的，這也是引起臨床耐藥菌暴發和流行的主要原因，使得ESBLs的菌株能夠通過一定的形式轉移或傳遞給敏感的非產ESBLs型的菌株，這給臨床的防控帶來了一定的難度。

8.1 CTX-M型ESBLs菌株的流行原因

產ESBLs臨床菌株，其所在的質粒不僅攜帶β-內酰胺類抗生素耐藥基因，而且還同時存在其他耐藥基因如氟喹諾酮類、氨基糖苷類、磺胺類藥物的耐藥基因，在這種情形下，就不可避免地出現了多重耐藥，鑒于此，在臨床中應及時地去檢測產ESBLs菌株，協同相關藥物的耐藥表型，去判斷是否為多重耐藥菌株，這對于指導臨床用藥具有重要意義。再者，CTX-M型基因的本身理論特性在一定程度上也加劇了CTX-M型ESBLs菌株的廣泛流行，其原因主要體現在以下兩個方面：第一，這主要是在于CTX-M型耐藥基因大多存在于可接合轉移的質粒上，為流行傳播提供了前提條件；第二，該移動質粒上攜帶的不同遺傳元件(如插入序列、轉座子和整合子等)在參與CTX-M型基因傳播與表達中也起到了一定的不容忽視的作用。因此，在多種因素共同作用下，導致了菌株的耐藥性傳播越來越嚴重，目前，已達到一發不可收拾的地步，全世界耐藥性問題變得日趨嚴峻。

另外，長期加量、濫用藥物尤其是β-內酰胺類藥物在一定程度上對動物機體產生了很大的危害，不僅會導致機體內的腸道菌群失調、紊亂甚至產生多重耐藥性，而且還嚴重影響公共衛生的安全。臨床中長期加量、濫用藥物，而機體內代謝、吸收是有一定限度的，甚至有些藥物不可能被完全吸收，導致其在體內蓄積，日積月累，蓄積的藥物量增加。同時，因長期、大劑量使用藥物，機體內不可避免地會出現耐藥基因，這在一定程度上降低了藥物的臨床療效，此外，還伴有一定的毒副作用。由于惡性循環的作用，機體內存在的耐藥基因通過多種途徑，可擴散、傳播到環境(水、土壤、食品中等)中，進一步將耐藥范圍擴大，形成惡性循環式的全球性耐藥問題。

8.2 CTX-M型ESBLs菌株的治療措施

我國動物源CTX-M型ESBLs的菌株的分離率呈現增長趨勢。在臨床實踐中，通過開展藥物敏感性試驗，選用較為敏感的藥物去治療相關動物疾病的感染。目前，碳青霉烯類抗生素如亞胺培南、美羅培南，本身具有特殊的空間結構特征，不容易被β-內酰胺酶降解，可治療產ESBLs菌株的感染。目前，在臨床實踐中，抗菌活性最強、應用最為廣泛的是美羅培南、亞胺培南。目前，針對產ESBLs菌株的感染，根據臨床實踐經歷，選用β-內酰胺類和β-內酰胺酶抑制劑聯用、頭孢菌素類及碳青霉烯類抗生素去治療較為合適。在其他類抗生素方面，氨基糖苷類和氟喹諾酮類抗生素可用來治療產CTX-M型ESBLs菌株的感染，具有一定的敏感性，但由于氟喹諾酮類抗生素對軟骨發育有影響及氨基糖苷類抗生素的耳、腎毒性作用，在臨床實踐應用中受到一定的限制。

為有效控制細菌產生ESBLs和治療產酶菌株的感染，第一，應當減少臨床中抗生素的使用頻次及注意合理科學用藥，在一定程度上減少攜帶產CTX-M型的菌株[54]；第二，目前已有β-內酰胺酶抑制劑(如棒酸、他唑巴坦、舒巴坦等)應用于臨床，可考慮聯合應用β-內酰胺酶抑制劑；第三，加大研發力度，研制更多的中藥、新藥應用于臨床[55]；第四，政府及監管部門應加強對感染菌、敏感程度的監測力度，在一定程度上降低或減少耐藥菌株的出現。目前，隨著CTX-M型ESBLs多重耐藥菌株的出現，積極尋找新型、更加有效降低細菌耐藥性的方案顯得十分有必要。

9 小結

近年來，臨床中攜帶CTX-M型β-內酰胺酶基因菌株顯示出愈發流行的趨勢。當前，伴隨著科學技術的快速發展，新型檢測技術層出不窮，如脈沖場凝膠電泳、MLST、RAPD等新型分型技術被廣泛應用于基因檢測與基因分子分型中[56]。了解不同地區產β-內酰胺酶的流行趨勢，有效掌握CTX-M型β-內酰胺酶的亞型及分類特點，然后適當選用不同的抗菌藥物進行治療是很有必要的，對臨床指導合理用藥具有重要現實意義。

總之，隨著對CTX-M型ESBLs的不斷認識，且耐藥性是一個世界性熱點問題，在臨床實踐中，應重視ESBLs菌株的臨床檢測和加強該酶型的監測力度。不同類型ESBLs基因的獲得和傳播，在一定程度上，與相關的整合子、轉座子和接合性質粒等可移動遺傳元件有著很大的關聯，而這些元件可以在不同菌株間進行快速的傳播和轉移，這就導致了攜帶的ESBLs基因檢出率高。一些可移動的遺傳元件可以快速有效地傳遞ESBLs基因，而且各種可移動遺傳元件之間可能也會發生相互作用、相互影響，這些都會使對可移動遺傳元件的研究變得更為復雜。鑒于此，可移動遺傳元件對ESBLs基因、其他基因傳播的影響及其傳播擴散機制還需要進行深入細致研究。