薩拉米發酵成熟過程中微生物菌群變化及對風味的影響

韋友兵，吳 香*，周 輝，徐寶才，李新福

（1.肉品加工與質量控制國家重點實驗室，江蘇雨潤肉食品有限公司，江蘇 南京 211806；2.馬鞍山雨潤食品有限公司，安徽 馬鞍山 243000；3.安徽農業大學茶與食品科技學院，安徽 合肥 230036；4.合肥工業大學食品科學與工程學院，安徽 合肥 230009）

我國是世界上的肉類生產和消費大國，肉類產業消費大多局限于生鮮肉、傳統腌臘肉制品等，品種相對單一。發酵肉制品是指在自然或人工控制條件下，利用微生物的發酵作用，產生具有特殊風味、色澤和質地，并且具有較長保質期的肉制品[1]。發酵香腸一般情況下不需要冷藏保存，其主要利用較低的pH值和較低的水分活度來抑制雜菌和有害致病菌的生長繁殖[2]，進而延長貨架期，保證產品的質量。米蘭薩拉米是一種典型的發酵肉制品，在歐洲有極大的消費市場，但是在我國生產消費量較少，開發生產適合國內消費者食用的薩拉米已經逐漸成為國內肉制品發展的新方向。在發酵肉制品發酵和成熟的過程中，微生物菌群對產品的風味、色澤及安全性起著至關重要的作用[3]。發酵肉制品中常見的有益微生物主要有細菌、霉菌和酵母菌中的部分種屬，其中尤以乳酸菌[4]居多。乳酸菌在肉發酵中能提高終產品的衛生[5]和感官質量，是必要的發酵劑，是判定食品質量的一項重要微生物學指標[6]。由于肉制品的原料、初始菌落及加工工藝的不同，產品中產生了不同的風味及滋味物質，造成了不同發酵肉制品的風味各異。

本研究以米蘭薩拉米發酵香腸為研究對象，針對其發酵過程中主要發酵菌種的數量變化，研究薩拉米發酵成熟過程中微生物菌群的變化。通過監測薩拉米加工過程中菌落總數、乳酸菌、葡萄球菌、酵母菌及霉菌的變化情況，確定薩拉米發酵成熟過程中微生物菌群的變化趨勢及其對產品品質的影響。同時，通過分析發酵肉制品中的風味物質，確定其典型的呈香物質，對于鑒別產品的風味品質具有重要的借鑒意義。另外，分析薩拉米中的風味物質組成及相對含量，這對于推動薩拉米發酵成熟過程中風味形成過程和機理的研究具有重要作用。本研究有利于為米蘭薩拉米的生產加工提供理論依據和技術指導，提供一個科學、完整的質量品質評價體系，對于改善米蘭薩拉米的質量品質以進一步滿足消費者的需求具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料：冷凍豬肉、香辛料（黑胡椒、大蒜粉、米蘭薩拉米專用調料）、食鹽、葡萄糖、D-異抗壞血酸鈉、硝酸鉀、亞硝酸鈉等 江蘇雨潤肉食品有限公司；C6～C20烷烴標準品 美國AccuStandard Inc公司；二硫蘇糖醇、乙二胺四乙酸、乙二醇四乙酸、三羥甲基氨基甲烷、檸檬酸、檸檬酸三鈉、三氯乙酸、氯仿、甲醇、異丙醇、冰乙酸、乙醚、硫酸銅、氫氧化鈉、硫代巴比妥酸、十二烷基硫酸鈉、考馬斯亮藍、巰基乙醇、過硫酸胺碳酸鈉、鹽酸、NaOH、甘氨酸、Na2HPO4、KH2PO4、氯化鉀及甲醛溶液均為國產分析純。

菌種：SM-181型菌種發酵劑：由清酒乳桿菌（Lactobacillus sakei）和木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus）組成，生物量＞2.9×109CFU/g，購自科漢森（中國）有限公司。

培養基：改良MRS瓊脂培養基、葡萄球菌選擇性瓊脂培養基、沙保弱慶大氯霉素2瓊脂培養基、平板計數瓊脂培養基，購自北京陸橋技術有限公司。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-1FD單人單面凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司；UV-2600紫外-可見分光光度計 日本島津公司；Allegra-64R臺式冷凍離心機 美國Beckman公司；NHWY-200B臺式全溫度恒溫搖床 常州諾基儀器有限公司；2300 KjeltecTM自動凱氏定氮儀 丹麥Foss分析儀器公司；602S穩壓穩流電泳儀 北京六一儀器廠；FR-980生物電泳圖像分析系統 上海復日科技有限公司；Trace MS氣相色譜-質譜聯用儀 美國Finnigan公司；DB-5毛細管色譜柱（60 m×0.32 mm，1 μm）美國J&W Scientific公司；RE-52AA旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器有限公司；DC-12H氮吹儀 上海安譜科學儀器有限公司；L-8900氨基酸自動分析儀 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 薩拉米的加工工藝

米蘭薩拉米的主要加工工藝為：原料肉→解凍→預斬→絞制→撒料（發酵劑接種）→打散→攪拌→灌裝→發酵成熟→剝皮包裝[7]

操作要點：原料肉要求無筋膜、淤血及惡性雜質等，采用低溫解凍，解凍室溫度控制在0～4 ℃，解凍至中心溫度達到-2.5～-1.5 ℃即可；將原料肉投入斬拌鍋，斬拌至鍋內肉塊變小易于絞肉后，即可由傳送帶將肉餡送入絞肉機中，斬拌后肉溫不得超過0 ℃，隨后采用3.5 mm孔板對預斬后的肉塊進行絞制；將混合后的輔料（含菌種發酵劑，添加量10%～13%）均勻撒在傳送帶上的肉餡表面，經過打散機打散，使肉餡和輔料混合均勻；打散后的肉餡通過傳送帶送入攪拌機攪拌均勻，顏色均一，肉餡之間有黏連即可停止攪拌，出機待灌裝，攪拌后肉溫不得超過0 ℃；采用膠原蛋白腸衣灌裝，灌裝前腸衣用鹽水浸泡15～30 min；將稱質量后的肉餡倒入灌裝機內，進行自動打卡灌裝，腸體外面套上收縮網，附上掛繩，兩端打卡，灌裝后的腸體應飽滿緊繃，無肉眼可見氣泡；發酵成熟：具體發酵成熟工藝如表1所示；剝皮包裝：將產品表面的網套和腸衣去除，剝皮后的產品用刀從中間切成2 段，包裝完的產品可直接置于-20 ℃貯藏備用。

表 1 薩拉米發酵工藝及取樣點Table 1 Sampling time points during the fermentation process of Salami

1.3.2 薩拉米成熟過程中的取樣

薩拉米的發酵成熟工藝及取樣點如表1所示。對于不同取樣樣品，先將產品表面的網套和腸衣去除，避免裸露產品表面黏上白霉，進行剝皮包裝及貯藏，備用，以原料肉為對照。

1.3.3 薩拉米發酵成熟過程中微生物菌落總數的測定

通過菌落計數的方法研究薩拉米發酵成熟過程中菌落總數、乳酸菌、葡萄球菌、酵母菌和霉菌數量的變化，從而確定發酵成熟過程中微生物菌群的變化[8]。在無菌條件下準確稱取剪碎的樣品25 g，并勻漿處理，然后置于225 mL的無菌生理鹽水中，劇烈振蕩使其充分混勻，將混合液進行梯度稀釋后涂布于對應的培養基上，在適應的溫度條件下培養一定時間（表2）。將每個階段的薩拉米樣品在固體培養基上進行培養，每個樣品3 個平行。菌落計數方法參照GB 4789.2—2010《食品安全國家標準食品微生物學檢驗 菌落總數測定》。

表 2 薩拉米中不同菌屬的培養基及培養條件Table 2 Culture media and conditions for different microbial species in Salami

1.3.4 薩拉米揮發性風味物質測定

采用頂空吹掃捕集法提取、氣相色譜-質譜聯用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技術分離鑒定薩拉米中的揮發性風味物質種類及相對含量，并通過感官評定確定產品品質。將薩拉米樣品裁剪為1.5 mm見方的肉塊，將5 g左右樣品置于體積為40 mL的樣品瓶中，40 ℃頂空30 min；高純氦氣（99.99%）、275 kPa吹5 s，置于4 ℃保存，最長可保存5 h；將樣品加熱至60 ℃，氦氣40 mL/min吹掃13 min，Tenax吸附劑吸附，捕集阱加熱到220 ℃，氦氣220 ℃脫附2 min后，直接進入氣相色譜儀。捕集阱需在240 ℃保持30 min，以去除可能的殘留物或污染物以便下一次進樣。

色譜條件：色譜柱：J&W DB-5石英毛細管柱（60 m×0.25 mm，1 μm）；載氣（氦氣）流速1 mL/min；進樣接口溫度均為250 ℃；升溫程序：40 ℃保持3 min，以5 ℃/min速率升至130 ℃，8 ℃/min升至200 ℃，12 ℃/min升至250 ℃，保持7 min；分流比1∶10。

質譜條件：電子電離源；離子源溫度280 ℃；電子能量70 eV；激活電壓350 V；發射電流200 μA；質量掃描范圍30～550 m/z。

1.4 數據處理

所有數據采用SPSS 20.0軟件進行鄧肯氏多重比較和差異顯著性檢驗，采用Origin 8.6軟件進行分析和作圖。

2 結果與分析

2.1 薩拉米發酵成熟過程中的微生物菌群變化

2.1.1 菌落總數變化

圖1 薩拉米發酵成熟過程中的菌落總數變化Fig. 1 Changes in total number of colonies during processing of Salami

菌落總數是薩拉米產品檢測的重要指標之一。由圖1可知，在薩拉米加工發酵過程中，菌落總數隨著發酵成熟過程呈先顯著升高后緩慢增長再顯著降低的趨勢。原料肉在接種發酵菌后，菌落總數為6.77 （lg（CFU/g））；在腌制脫水及高溫發酵過程中，由于產品的溫度較高、相對濕度較大，水分活度顯著提高，導致微生物迅速繁殖；在高溫發酵結束后，產品的菌落總數達7.80 （lg（CFU/g））；在發酵7～15 d，薩拉米的菌落總數沒有太大變化，這與Ruiz-Moyano[9]、Arief[10]、杜莎[11]等的研究結果類似；隨著發酵成熟過程的繼續進行，薩拉米中的菌落總數呈顯著下降趨勢（P＜0.05），尤其是在發酵45 d的成熟階段，產品的菌落總數急劇降低至4.32 （lg（CFU/g））。這主要是由于發酵成熟后期營養物質減少、水分散失和發酵溫度降低，低水分、低溫的條件抑制了產品中微生物的生長；另外，由于發酵過程中乳酸菌的作用使得酸度值不斷降低，對微生物的生長也有一定的抑制作用。

2.1.2 乳酸菌數量變化

采用改良MRS培養基，通過鈣圈篩選的方法得到乳酸菌數量隨發酵時間的變化。由圖2可知，接種發酵菌后，薩拉米發酵成熟過程中的乳酸菌數量呈先顯著增加后穩定再顯著降低的趨勢，與菌落總數的變化趨勢一致。接種后原料中乳酸菌的數量為6.10 （lg（CFU/g）），并且在脫水、高溫發酵成熟以及發酵15 d的成熟階段，乳酸菌數量持續增加至7.63 （lg（CFU/g））；發酵15 d后，產品的乳酸菌數量呈顯著降低趨勢（P＜0.05），發酵成熟結束后為3.22 （lg（CFU/g））。乳酸菌數量在前期加工過程中總體變化趨勢較小，進入發酵期后變化顯著（P＜0.05）；而在發酵后期，乳酸菌數量逐漸降低主要是由于水分活度降低，pH值降低，鹽濃度上升，使得乳酸菌的生長受到抑制。乳酸菌是米蘭薩拉米發酵成熟過程中的主要優勢菌種，在發酵成熟過程中能夠利用原料中的糖類和含氮類物質進行發酵，產生乳酸，降低產品的pH值[12]。乳酸及少量的副產物，如琥珀酸、甲酸、乙酸等，可賦予產品特殊的風味，分解蛋白質中的氨基酸，產生特有的風味[13-15]，減少亞硝胺的生成，提高產品的食用安全性，對維持米蘭薩拉米的風味特征有重要貢獻。另外，本研究所采用的發酵劑中，清酒乳桿菌是產品發酵劑中的重要發酵菌種之一。Baka等[16]研究發現，清酒乳桿菌能夠顯著抑制發酵香腸中生物胺的形成。清酒乳桿菌對食源性致病菌單增李斯特菌有較強的抑制作用[17]，對薩拉米香腸的發酵和貯藏具有重要作用。

圖2 薩拉米發酵成熟過程中乳酸菌數量變化Fig. 2 Changes in Lactobacillus count during processing of Salami

2.1.3 葡萄球菌數量變化

圖3 薩拉米發酵成熟過程中的葡萄球菌數量變化Fig. 3 Changes in Staphylococcus count during processing of Salami

本研究針對發酵劑中另一重要發酵菌種（葡萄球菌），采用選擇性培養基對薩拉米發酵成熟過程中葡萄球菌的數量變化進行分析。由圖3可知：葡萄球菌的主要生長階段為脫水階段，在原料中接種發酵菌后，其數量迅速增加至7.35 （lg（CFU/g））；在高溫發酵成熟及發酵15 d的成熟階段，產品中的葡萄球菌數量有輕微降低，這主要是由于薩拉米經過脫水階段后，產品的水分含量和發酵溫度逐漸降低，影響了細菌的發酵；隨著發酵時間的繼續延長，產品中的酸度累積及水分散失導致葡萄球菌數量急劇下降；在發酵成熟結束后，其數量降低至2.18 （lg（CFU/g））。本研究中的木糖葡萄球菌是肉品發酵劑中常見的凝固酶陰性球菌[18-19]，在薩拉米發酵過程中，木糖葡萄球菌對產品中的揮發性風味物質有促進作用，具有硝酸鹽還原酶、蛋白質和脂肪水解能力[20-21]，產生乙偶姻，乙偶姻發酵產生特殊的薩拉米風味[22]，并且對肉制品中的蛋白質和脂質有顯著的分解功能，表現出與內源蛋白酶及脂肪水解酶相似的功效[23-24]。

2.1.4 酵母菌和霉菌數量變化

圖4 薩拉米發酵成熟過程中的酵母菌和霉菌數量變化Fig. 4 Changes in yeast/mold count during processing of Salami

由圖4可知：由于在原料發酵菌中未添加酵母菌，接種后原料中的酵母菌和霉菌數量僅為5.31 （lg（CFU/g））；經過脫水及高溫發酵成熟后，其數量顯著增加至6.25 （lg（CFU/g））；隨著發酵過程的繼續進行，產品中的酵母菌及霉菌數量逐漸降低至3.22 （lg（CFU/g））。在發酵肉制品中，酵母菌和霉菌主要生長于肉制品表面，使肉制品減少與氧氣和光的直接接觸，起到抗酸敗作用[25-27]，對肉制品的香氣有重要貢獻。在高溫發酵階段，溫度和相對濕度較高，霉菌數量顯著上升，而霉菌中90%以上是青霉，它隨著溫度的變化而變化，在薩拉米香腸內部很少發現，說明霉菌的生長與薩拉米加工過程中的環境溫度和相對濕度有關。但是隨著發酵過程中水分的散失和pH值的降低，產品中的酵母菌和霉菌數量也急劇降低，但酵母菌數量的下降在發酵后期，表明酵母菌有更強的抗酸和抗低水分含量的能力，這與杜莎等[11]的研究結果一致。

2.2 薩拉米中的揮發性風味物質分析

由圖5及表3可知，分析不同保留時間出現的吸收峰可以得出，薩拉米中共檢出58 種揮發性風味物質，分別為烴類（12 種）、醇類（12 種）、醛類（10 種）、酯類（4 種）、酮酸類（7 種）、酚醚類（5 種）及其他（8 種）。不同風味物質的相對含量分別為烴類34.30%、醇類13.29%、醛類17.17%、酯類1.43%、酮酸類8.21%、酚醚類18.39%、其他類7.21%。

圖5 薩拉米中揮發性風味物質的GC-MS檢測總離子流圖Fig. 5 Total ion current chromatogram of volatile fl avor compounds from Salami detected by GC-MS

表 3 薩拉米中的揮發性風味成分Table 3 Volatile fl avor components of Salami

續表3

烴類、醇類、醛類、酮酸類和酚類物質是發酵肉制品風味物質的重要組成部分。烯烴類風味成分大部分閾值較低，且具有明顯的果香味；醇類風味物質主要來源于烯烴類物質的氧化、脂肪碳鏈的斷裂及微生物的代謝；醛類中的小分子醛類物質閾值較低，具有明顯的香味，來源于醇類物質的進一步氧化；酮酸類風味成分是烴類、醇類成分氧化的最終產物，主要來源于脂肪酸鏈的氧化及微生物的發酵；酚類風味物質具有明顯的芳香味及脂香味，在發酵肉制品中主要來源于微生物的代謝及香辛料；醚類物質在常溫條件下大多呈香味，其閾值和呈味特點與碳鏈的組成有明顯的相關性，主要來源于香辛料中的呈味物質，這些特征風味物質均能顯著提高發酵肉制品的風味品質[14,21]。

在薩拉米中檢測到的12 種烴類揮發性風味物質全部為烯烴類，分別為3-崖柏烯、（1R）-（+）-α-蒎烯、檸檬烯、（1S）-（-）-β-蒎烯、3-蒈烯、3,7,7-三甲基-二環[4,1,0]庚-2-烯、異松油烯、γ-萜品烯、α-蒎烯、β-欖香烯、β-石竹烯和1-壬炔。在薩拉米中檢測到較多的烯烴類揮發性物質，這可能是由于添加的香辛料及專用調料及微生物發酵導致。檢測到的12 種醇類風味物質分別為乙醇、2,3-丁二醇、1-戊烯-3-醇、十一烷基醇、1-甲基環己醇、2,3-蒎烷二醇、桃金娘烯醇、4-萜烯醇、1-甲基-4-（1-甲基乙烯基）-環己醇、順-3-壬烯-1-醇、芳樟醇和β-苯乙醇。這些醇類物質對薩拉米的風味品質有重要貢獻，例如，萜烯醇和芳樟醇呈明顯的木香味，β-苯乙醇則具有清淡的玫瑰花香，在發酵肉制品中的主要來源為烴類及脂肪酸鏈的氧化及黑胡椒等調味料。檢測到的10 種醛類揮發性風味成分分別為2-甲基丁醛、2-乙基丙烯醛、苯甲醛、2-羥基庚醛、3-甲基丁醛、辛醛、反,反-2,4-壬二烯醛、順-7-癸烯醛、2-苯基巴豆醛和壬醛。其中，2-甲基丁醛和3-甲基丁醛是發酵肉制品中典型的呈味物質，廣泛存在于不同的發酵香腸、火腿及腌臘肉制品中，主要來源于氨基酸的脫氨脫羧反應，這主要是由于肉中的蛋白質等物質在微生物及其相應產物的作用下分解為氨基酸，使得蛋白質分解產生小分子風味成分的前體物質，促進薩拉米風味的形成；另外，苯甲醛、辛醛和壬醛等醛類風味成分也具有明顯的芳香味，對構成發酵肉制品的風味特征有重要貢獻。同時，在薩拉米中共檢測到4 種酯類風味成分。檢測到的7 種酮酸類物質分別為環己酮、2-壬酮、2,4-二烯庚酮、6-壬烯酮、乙酸、3-羥基丁酸和庚酸。庚酸和2,4-二烯庚酮具有明顯的香草味，對發酵肉制品的香味有重要貢獻。檢測到的2 種酚類物質分別為丁香酚和2,6-二叔丁基對甲酚，具有明顯的丁香香味和溫和的辛香味，主要來源于香辛料及乳酸菌的發酵，在發酵酸化階段乳酸菌作用最大，能夠賦予產品微酸、醇香的發酵風味。檢測到的3 種醚類物質分別為4-烯丙基苯甲醚、異丁香酚甲醚和肉豆蔻醚。其中，4-烯丙基苯甲醚是相對含量最高的醚類，主要來源于大茴香；另外，異丁香酚甲醚也是一種重要的呈香物質，其主要來源于香辛料，是發酵肉制品風味的重要組成部分。另外還檢測到苯環類、呋喃類等其他風味成分共8 種，分別為間二甲苯、2-正戊基呋喃、對異丙基甲苯、間異丙基甲苯、樟腦、1,4-二甲氧基苯、甘菊藍和蓽澄茄油萜，這些風味成分的呈味特征大多表現為芳香味及果香味等，主要來源于氨基酸的降解、脂肪氧化、微生物代謝及香辛料，能夠增加發酵肉制品風味的多樣性。

2.3 薩拉米質量檢驗報告

表 4 薩拉米質量檢測結果Table 4 Sensory and chemical properties of Salami

以Q/MYB 0007S—2017《發酵肉制品系列》為執行標準，對薩拉米進行檢測，檢測機構為第三方檢測機構。由表4可知，薩拉米所檢測項目，包括感官指標、過氧化值、重金屬含量、亞硝酸鹽含量等指標均符合Q/MYB 0007S—2017標準要求，說明在薩拉米生產過程中，有效控制發酵溫度、時間、相對濕度及發酵菌種可以有效提高產品的品質及安全性。

3 結 論

乳酸菌、葡萄球菌、酵母菌和霉菌是米蘭薩拉米發酵成熟過程中的主要優勢菌，并且隨著發酵時間的延長，產品中的微生物數量呈先升高后降低的趨勢，其中高溫發酵成熟階段及中溫發酵成熟階段是米蘭薩拉米發酵成熟過程中微生物生長的主要階段。通過GC-MS法分析米蘭薩拉米中的揮發性風味物質，共檢出58 種揮發性風味物質，分別為烴類（12 種）、醇類（12 種）、醛類（10 種）、酯類（4 種）、酮酸類（7 種）、酚醚類（5 種）及其他（8 種）。發酵過程中，發酵優勢菌對薩拉米成熟過程中的風味物質具有積極影響。另外，米蘭薩拉米所檢測項目的結果均符合Q/MYB 0007S—2017標準的要求。本研究可以為米蘭薩拉米的生產加工提供理論依據和技術指導，并提供一個科學、完整的質量品質評價體系，有助于改善米蘭薩拉米的質量品質，進一步滿足消費者的需求，有助于推進我國肉類工業的發展。