脊髓神經元鉀通道在鞘內嗎啡預處理減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷中的作用

劉潤宇，張 野

鞘內嗎啡預處理對大鼠心肌缺血再灌注損傷具有保護作用[1]，明確其機制具有重要意義。Wong et al[2]報道鞘內注射嗎啡進行遠端預處理，主要是通過激活脊髓阿片受體對遠隔心臟發揮保護作用，而脊髓神經元上的多種鉀通道均能被阿片受體激活，作為其下游效應器發揮作用[3-4]。該研究擬評價脊髓神經元鉀通道在心肌缺血再灌注損傷及鞘內嗎啡預處理減輕心肌缺血再灌注損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1主要儀器和試劑ALC-V9型動物呼吸機(上海奧爾科特生物科技有限公司)；BL-420S型連接生物機能系統(成都泰盟生物科技有限公司)；PE-10導管(英國Smiths Medical 公司)；鹽酸嗎啡注射液(1 ml ∶10 mg，批號130904-1，東北制藥集團沈陽第一制藥有限公司)；格列苯脲(GLI,貨號G0639-5G-9)、尼可地爾(NICO,貨號N3539-50MG)(美國Sigma公司)。

1.2SD大鼠鞘內置管模型制備選取健康成年雄性SD大鼠，體質量250～350 g，由安徽醫科大學動物實驗中心提供。腹腔注射3%戊巴比妥鈉40 mg/kg麻醉后，參照文獻[5],在大鼠頸背部沿脊柱切開皮膚約2 cm，逐層分離肌肉組織，使寰枕膜暴露，用12號針頭輕輕挑破寰枕膜，自挑破處將PE-10導管向尾端置入蛛網膜下腔約4 cm，固定導管，縫合傷口。術后肌肉注射青霉素10萬U,予以單籠飼養3 d，以備下一步實驗。

1.3SD大鼠心肌缺血再灌注損傷模型建立使用鞘內置管成功后飼養3 d，無感染和感覺運動功能異常的SD大鼠，腹腔注射3%的戊巴比妥鈉，劑量為60 mg/kg。麻醉后固定于手術臺上，切開氣管，插入氣管導管并固定，使用ALC-V9型動物呼吸機機械通氣控制呼吸，潮氣量按照20 ml/kg計算，呼吸頻率70次/min。連接BL-420S型連接生物機能系統，監測記錄心電圖。沿胸骨左側4～5肋間開胸，置入胸撐，鈍性分離心包膜，準確找到左心耳，使用棉簽輕輕撥開左心耳，用針將6-0聚丙烯線自肺動脈圓錐和左心耳下方以冠狀靜脈主為中心穿過，進針深度約為3 mm，寬度3～5 mm。將線穿過可控制開放的冠狀動脈左前降支阻斷器(利用兩個移液器槍頭自制)中。封閉阻斷器，使線結收緊，造成左前降支支配的心肌缺血，該區域的心肌顏色隨阻斷時間增加逐漸發白，心電圖呈明顯的心肌缺血改變(ST段抬高或降低等)，甚至出現頻繁的室性早搏。心律失常表現在缺血后的5 min左右最為顯著。缺血30 min后，通過松開線結進行再灌注，心律失常在恢復灌注后立即出現，尤以室性心律失常常見，后心律逐漸平穩，ST段逐漸下降，缺血區域心肌發紺現象逐漸緩解。再灌注時間為120 min。

1.4實驗分組本實驗主要研究脊髓神經元鉀通道在鞘內嗎啡預處理減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷過程中的作用和機制。為此本實驗使用鞘內成功置管的大鼠共70只，隨機分成7組，每組10只。分別為Sham組、IRI組、IRI+鉀通道開放劑(尼可地爾，NICO)組、ITMP組、ITMP+鉀通道阻滯劑(格列本脲，GLI)組以及兩組對照組：Sham+鉀通道開放劑(NICO)組和IRI+鉀通道阻滯劑(GLI)組。① Sham組：腹腔內注射戊巴比妥鈉麻醉后，固定于手術臺，氣管切開插管，開胸后于肺動脈圓錐與左心耳間穿線但不結扎，連接生物機能系統，監測心電圖。190 min后處死，留取心臟和脊髓組織。② IRI組：6-0聚丙烯線在肺動脈圓錐與左心耳間的冠狀動脈左前降支下方穿線。穩定40 min后，結扎冠狀動脈左前降支，心肌缺血30 min；松開線結，恢復灌注120 min。結扎前30 min，模擬嗎啡預處理向鞘內注射10 μl生理鹽水，注射時間5 min，重復3次，每次間隔5 min。③ ITMP組：6-0聚丙烯線在肺動脈圓錐與左心耳間的冠狀動脈左前降支下方穿線。穩定40 min后，結扎冠狀動脈左前降支，心肌缺血30 min；松開線結，恢復灌注120 min。結扎前30 min，鞘內輸注嗎啡(3 μg/kg)10 μl，持續5 min，再停止5 min，循環3次。④ IRI+NICO組：6-0聚丙烯線在肺動脈圓錐與左心耳間的冠狀動脈左前降支下方穿線。穩定40 min后，結扎冠狀動脈左前降支，心肌缺血30 min；松開線結，恢復灌注120 min。結扎前40 min，鞘內注射鉀通道開放劑NICO 10 μl(100 μg,劑量參照文獻[6])；結扎前30 min，模擬嗎啡預處理向鞘內注射10 μl生理鹽水，注射時間5 min，重復3次，每次間隔5 min。⑤ ITMP+GLI組：6-0聚丙烯線在肺動脈圓錐與左心耳間的冠狀動脈左前降支下方穿線。穩定40 min后，結扎冠狀動脈左前降支，心肌缺血30 min；松開線結，恢復灌注120 min。結扎前40 min，鞘內注射鉀通道阻滯劑GLI 10 μl(50 μg)；結扎前30 min，鞘內輸注嗎啡(3 μg/kg) 10 μl，持續5 min，再停止5 min，循環3次。⑥ Sham+NICO組：開胸后于肺動脈圓錐與左心耳間冠狀動脈下方穿線但不結扎，連接生物機能系統，監測心電圖，鞘內注射鉀通道開放劑NICO 10 μl(100 μg)，注射后監測190 min處死留取心肌組織和脊髓。⑦ IRI+GLI組：6-0聚丙烯線在肺動脈圓錐與左心耳間的冠狀動脈左前降支下方穿線。穩定40 min后，結扎冠狀動脈左前降支，心肌缺血30 min；松開線結，恢復灌注120 min。結扎前40 min，鞘內注射鉀通道阻滯劑GLI 10 μl(50 μg)；結扎前30 min，模擬嗎啡預處理向鞘內注射10 μl 生理鹽水，注射時間5 min，重復3次，每次間隔5 min。

1.5標本采集和指標檢測觀察心電圖，記錄再灌注30 min 內室性心律失常[室性早搏(premature ventricular contractions，PVCs)及室速∕室顫(ventricular tachycardia/ventricular fibrillation，VT/VF)]發生次數。再灌注120 min后，處死大鼠，取出心臟并置于離體心臟灌流架，通過灌流針向主動脈內注入K-H液(37 ℃)沖洗5 min，沖洗出心肌內殘留血液。重新結扎冠狀動脈左前降支，并從主動脈注入0.25%伊文思藍溶液，置于-80 ℃冰箱速凍1～2 h。將冰凍的心臟由心尖到冠狀動脈結扎線處平切2 mm厚的心肌切片，5～6片。切片置于1%TTC溶液中，37 ℃(pH 7.4)孵育15 min，取出置于10%福爾馬林室溫固定12 h。染色后缺血危險區呈紅色，梗死區為白色，采用Image J 1.38e圖像分析軟件測定缺血危險區體積(area at risk,AAR)、梗死區體積(infarct size,IS)，并計算IS/AAR比值，以反映心肌梗死面積。

2 結果

2.1室性心律失常次數與Sham組比較，IRI組PVCs和VT/VF發生次數增加；與IRI組比較，IRI+NICO組、ITMP組 PVCs和VT/VF發生次數均減少；與ITMP組比較，ITMP+GLI組PVCs和VT/VF發生次數增加(P<0.05)。見表1。

2.2TTC染色結果與Sham組比較，IRI組IS/AAR比值升高；與IRI組比較，IRI+NICO組、ITMP組IS/AAR比值均降低；與ITMP組比較，ITMP+GLI組IS/AAR比值升高(P<0.05)。見表2、圖1。

圖1 各組大鼠心肌TTC檢測結果

表1 7組大鼠PVCs和VT/VF發生次數的比較

與Sham組比較：*P<0.05；與IRI組比較：#P<0.05；與ITMP組比較：△P<0.05

表2 7組大鼠心肌病理學指標比較

與Sham組比較：*P<0.05；與IRI組比較：#P<0.05；與ITMP組比較：△P<0.05

3 討論

本研究采用了左冠狀動脈結扎缺血30 min，再恢復灌注的方法制備心肌缺血再灌注模型，實驗結果表明：相比于Sham組，IRI組的PVCs和VT/VF發生次數增加，IS/AAR比值升高,提示心肌缺血再灌注模型制備成功。相比于IRI組，ITMP組的PVCs和VT/VF發生次數減少，IS/AAR比值降低，提示鞘內嗎啡預處理具有減輕心肌缺血再灌注損傷的保護作用。

脊髓是外周各種感覺以及傷害信息傳遞到中樞的樞紐，位于其上的背根神經節中樞突在此與上級神經元換元，從而將外周信息轉到至中樞并使中樞釋放神經遞質[7]。Welch et al[8]率先提出，鞘內注射鉀通道開放劑能增加機體對外周傷害性刺激的耐受性，產生鎮痛作用。此后的研究[9-12]也證實了這一觀點。而脊髓鉀通道開放對心肌缺血再灌注損傷是否有保護作用，先前并沒有研究證實。本實驗中,IRI+NICO組較IRI組的PVCs和VT/VF發生次數明顯減少，IS/AAR比值顯著降低(P<0.05)。提示脊髓神經元鉀通道開放能減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷。這可能與脊髓神經元上鉀通道開放，大量鉀離子外流，細胞超級化使得神經元細胞內鈣離子減少，神經元細胞興奮性降低，抑制了傷害性刺激的傳遞有關。

在本實驗中，為了研究脊髓神經元鉀通道是否參與鞘內嗎啡預處理減輕心肌缺血再灌注損傷這一機制，進行了ITMP+鉀通道阻滯劑組實驗。實驗顯示，與ITMP組比較，ITMP+GLI組PVCs和VT/VF發生次數增加,IS/AAR比值升高(P<0.05),提示鞘內神經元鉀通道的關閉可減弱ITMP的心肌缺血再灌注損傷保護作用。已經有研究[8]證明脊髓上的阿片受體能激活脊髓神經元鉀通道，并通過鉀通道的開放提高對傷害性刺激的耐受性，從而產生鎮痛作用。胡軍 等[13]研究發現NO-cGMP-PKG通路參與了ITMP減輕大鼠心肌IRI的過程。而其下游蛋白PKG可以激活脊髓神經元鉀通道[14]。由此可以推測ITMP通過NO-cGMP-PKG通路激活脊髓神經元鉀通道，使鉀離子外流，細胞超極化增加了神經元對傷害性刺激的耐受性。從而減輕大鼠心肌IRI，發揮心肌保護作用。

綜上所述，脊髓神經元鉀通道開放能減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷，脊髓神經元鉀通道參與了鞘內嗎啡預處理減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷作用的過程。