含胱天蛋白酶富集功能域凋亡抑制因子在心血管疾病中的研究進展

李 奇，楊 俊，楊 簡，楊 英

三峽大學第一臨床醫學院心內科 心血管病研究所，湖北宜昌 443002

隨著生活水平的不斷提高，國民不健康生活方式越來越多，我國居民心血管疾病(cardiovascular diseases，CVD)患病率以及死亡率仍處于上升階段且居高不下，早已超過腫瘤和其他疾病成為威脅人類健康的“頭號殺手”[1]。細胞凋亡是由多種基因控制的程序性死亡，其中凋亡引起的心肌細胞死亡能導致多種CVD如心肌病、心肌肥厚、心力衰竭的發生，是CVD發生發展過程中不可缺少的環節之一。因此，尋找心臟特異性表達的抗凋亡蛋白如含胱天蛋白酶富集功能域凋亡抑制因子(apoptosis repressor with caspase recruitment domain，ARC)已成為防治CVD研究的熱門領域。

ARC的結構與特點

ARC作為心臟中唯一一種高表達的抗凋亡蛋白，最早發現于大鼠的嗜鉻細胞瘤與腦組織的cDNA文庫中，通過對其結構與功能的分析發現，此蛋白帶有胱天蛋白酶富集功能域(caspase recruitment domain，CARD)并與半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase)-2、Caspase-9以及凋亡蛋白酶激活因子-1的CARD結構域高度同源，因此ARC與凋亡具有密切聯系[2]。來源于人的ARC cDNA編碼的蛋白質含208個氨基酸，相對分子質量為2260，并與大、小鼠源ARC蛋白有很高的同源性，而且人類與小鼠以及大鼠的ARC蛋白均含有兩個不同的結構域，分別為N端CARD結構域和C端富含脯氨酸與谷氨酸殘基的結構域[3]。此外，人源性ARC蛋白具有兩個轉錄子，分別編碼ARC蛋白與一種相對分子質量為3000的相關的核仁蛋白，然而關于其核仁蛋白的作用目前尚無定論。生理情況下，ARC主要分布在骨骼肌、心肌和大腦等終末分化組織中，且在胞質與胞核中均有表達，而胞質中的ARC可以與死亡受體結合以及抑制線粒體凋亡途徑發揮抗凋亡作用[4]。由此合理推測ARC蛋白可通過其抗凋亡作用來抑制心肌細胞凋亡，從而改善心臟功能。除了在終末分化組織中表達之外，ARC也被發現存在于乳腺、結腸、子宮頸等癌細胞系中[5-6]。早期研究顯示，在乳腺浸潤性癌變組織中ARC陽性表達率明顯高于正常乳腺組織，提示ARC與癌細胞的發生發展關系密切[7]。

ARC的抗凋亡作用

細胞凋亡作為生命的基本現象，不僅在維持內環境穩定和組織器官發育中發揮至關重要的作用，還參與多種疾病的病理生理過程。如前所述，ARC主要通過兩條經典途徑發揮抗凋亡作用。一條由死亡受體介導的外源性途徑，即ARC的CARD結構域能夠直接與Fas以及帶有死亡結構域的Fas相關蛋白(Fas-associating protein with a death domain，FADD)的死亡結構域競爭性結合，阻斷Fas和FADD之間相互作用，導致死亡誘導信號復合體的組裝無法順利完成，從而抑制外源性凋亡途徑，同時ARC的CARD結構域也可以直接與Caspase-8結合抑制其活化，進而阻斷Caspase-8介導的凋亡反應[2，8]。另一條則是由線粒體介導的內源性途徑，在胞質內ARC的CARD結構域直接與促凋亡蛋白Bax的C端結合，抑制Bax從胞漿內進入線粒體，降低電勢差和膜通透性的變化從而導致細胞色素c的釋放減少，從而阻斷內源性凋亡途徑，同時ARC的CARD結構域還可以直接與p53上調凋亡調控因子以及Bad結合從而釋放抗凋亡因子Bcl-2發揮其內源性抗凋亡作用[8-10]。因此，ARC是目前少數已知的具有抗外源性以及內源性凋亡生物學功能的分子蛋白，其抗凋亡功能依賴其特殊的蛋白結構功能域。此外，研究顯示在H9C2心肌細胞中ARC可維持細胞內K+濃度平衡從而保持細胞體積正常，其可通過阻斷K+通道，抑制K+外流引起的細胞皺縮以及心肌細胞凋亡[11]。

另一方面，研究表明只有當ARC磷酸化后才能發揮抗凋亡作用，同時磷酸化的ARC也可以經去磷酸化作用而喪失其活性[12]。Tan等[13]研究證實，醛固酮與異丙腎上腺素刺激引起的凋亡，并沒有降低ARC的表達水平，但卻通過去磷酸化作用抑制了ARC的抗凋亡能力。此外，ARC還受到泛素-蛋白酶體介導的降解作用，通過泛素E3連接酶小鼠雙微體2(murine double minute 2，MDM2)與ARC相結合從而導致ARC的表達降低，因此MDM2可能是ARC蛋白表達的重要調節因子，而當ARC泛素化位點突變時也可抑制凋亡刺激物誘導的ARC表達降低，從而發揮其抗凋亡作用[14]。

ARC在心血管疾病中的作用及機制

由于ARC蛋白強大的抗凋亡作用，其在心臟生理功能維持方面起著重要的保護效應，心臟一旦受到刺激如心肌缺血/再灌注損傷(myocardial ischemia/ reperfusion injury，MI/RI)、心肌損傷、心臟瓣膜功能障礙，ARC便能夠介導抗凋亡作用改善心臟功能。病理條件下，ARC表達下調也可能導致多種心臟疾病的發生，如心肌肥厚、心力衰竭(heart failure，HF)和心肌梗死等[15-17]。

ARC與MI/RI 凋亡反應作為MI/RI發病機制中的關鍵環節之一，在MI/RI的發生發展過程中發揮重要作用。Pyo等[18]采用結扎冠狀動脈左前降支建立MI/RI模型，結果發現與野生型小鼠相比，特異性表達ARC的轉基因小鼠(TgARC)心肌梗死面積顯著減少，心肌損傷得到明顯改善。Donath等[19]對ARC基因敲除小鼠進行I/R處理發現，與對照組相比，ARC敲除小鼠心肌梗死面積顯著增加，其心肌凋亡細胞量也提高了近2.5倍。以上結果表明ARC蛋白的表達能夠有效改善MI/RI。在MI/RI的離體實驗中，Yao等[12]通過H9C2心肌細胞缺氧/復氧(hypoxia-reoxygenation，H/R)模型發現，ARC蛋白表達量并沒有發生明顯變化，但卻顯著降低了ARC磷酸化表達，同時伴有線粒體中細胞色素C的釋放和Caspase-3的激活，而當ARC表達上調并發生磷酸化后可以明顯減少由H/R誘導的H9C2細胞凋亡，其機制與ARC能夠調控Fas、Cyt-c以及Caspase-3等相關凋亡因子的表達有關，且只有當ARC磷酸化后才能發揮其抗凋亡作用。此外，該研究組還發現，硫氫化鈉作為硫化氫的供體和原料可以增強ARC磷酸化抑制MI/RI誘導的心肌細胞凋亡從而改善MI/RI，進一步證實ARC的抗凋亡活性可能依賴于其磷酸化狀態[12]。新近研究顯示，小劑量的醛固酮受體拮抗劑如螺內酯或依普利酮可以有效抑制Caspases-2、3、9的激活從而減輕MI/RI，其主要作用機制是醛固酮可通過泛素-蛋白酶體途徑導致ARC的降解，而螺內酯或依普利酮可減少ARC的降解進而抑制心肌細胞凋亡[20]。以上結果表明ARC可能是臨床防治MI/RI有效的藥物干預靶點。另一方面，Xu等[21]最新研究顯示在MI/RI發生過程中，ARC還可以通過抑制線粒體膜通透性轉換孔的開放調控心肌程序性壞死，減少心肌梗死面積，這證實ARC可能在心肌壞死過程中存在一定作用。

ARC與心肌肥厚 盡管凋亡與細胞肥大是不同的兩種途徑，但兩者存在著共同的刺激因子如血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ)，腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-，TNF-)，而且細胞凋亡還可以誘導心肌代償性肥大持續惡化發展為心力衰竭[17]，所以，ARC蛋白在心肌肥厚中的作用是不可忽視的。Murtaza等[22]通過Ang Ⅱ、TNF-、苯腎上腺素刺激誘導小鼠心肌肥大顯示，ARC磷酸化水平以及酪蛋白激酶2(casein kinase 2，CK2)活性明顯降低，而上述刺激效果又能被ARC過表達所抑制，因此ARC過表達可能抑制心肌肥厚的發展，同時敲除內源性的ARC抑制其表達或阻止其磷酸化又可以誘導心肌肥厚的發生。其中CK2是ARC的上游調控因子，能夠促使ARC蛋白上的149位蘇氨酸發生磷酸化，從而發揮抗心肌肥厚作用。進一步研究顯示，ARC在預防內皮素-1誘導的心肌肥厚中具有潛在的干預作用，且ARC對心肌肥厚的改善依賴于其對活性氧的清除，并證實CK2介導ARC磷酸化進而協同對抗心肌肥厚[23]。萬帝等[24]通過腹主動脈縮窄法建立高血壓誘導大鼠心肌肥厚模型同樣發現ARC是改善心肌肥厚與凋亡的關鍵調控蛋白質，通過提高ARC磷酸化修飾水平可強化其功能狀態，有效抑制高血壓所致的心肌細胞肥大相關信號通路的激活。此外，趙婧[25]采用胰島素誘導建立肉雞心肌細胞肥大模型，結果提示ARC蛋白可以通過其C末端與Ca2+結合，阻斷由ATP刺激引起的Ca2+濃度升高，較低濃度的Ca2+抑制原癌基因c-myc的表達，從而在一定程度上抑制心肌細胞的肥大和凋亡。因此，ARC具有抑制心肌肥厚的作用，其機制可能與其磷酸化水平以及心肌細胞中原癌基因的抑制有關。

ARC與心力衰竭 有研究顯示，HF終末期的患者心肌組織中ARC蛋白表達較心功能正常心肌組織減少了36.7%[19]。由此推斷，HF的發生發展可能與ARC的表達有關。Li等[26]通過小鼠橫主動脈縮窄建立HF模型，經腺病毒轉染誘導ARC過表達后發現，ARC表達上調可以降低Caspase家族相關因子的活性從而抑制外源性與內源性凋亡途徑，最終在HF的發展過程中提供心肌保護作用。但ARC的抗凋亡作用可被HF的介體分揀連接蛋白13(sorting nexin-13，SNX13)調控，SNX13的N-端PXA結構域可以介導ARC在胞內的運輸，有效防止ARC被溶酶體降解，因此，SNX13可以促進ARC的穩定從而抵抗HF的發展。為進一步證實ARC在心肌組織中抗HF作用及機制，Wang等[17]研究發現心臟特異性表達TgARC小鼠在HF模型中同樣具有心肌保護作用，而微小RNA(microRNA，miRNA)-223作為HF的正調控因子可通過抑制其下游靶點ARC表達誘導HF進一步惡化。值得一提的是，一種新發現的一類非編碼RNA—環狀RNA(circular RNA，circRNA)可以作為miRNA海綿與miR-223相互作用從而導致ARC的表達增加，以上結果提示ARC與miR-223以及circRNA可以組成一條新的調節途徑，為HF的治療提供有吸引力的靶點。

ARC與其他心臟性疾病 急性病毒性心肌炎(acute viral myocarditis，AVMC)發展過程中，心肌細胞可呈凋亡樣改變并顯著增加，提示心肌細胞凋亡同樣參與了AVMC的病理生理過程[16]。湯道文等[27]通過注射柯薩奇病毒B3建立小鼠AVMC模型，7 d后ARC錯義寡核苷酸組的ARC表達水平明顯高于對照組，而其心肌損傷程度遠遠小于對照組，表明在AVMC小鼠中高表達的ARC可以抑制心肌細胞凋亡，保護心肌組織免受凋亡因子帶來的損傷，其機制可能與抑制動力相關蛋白介導的Caspase相關因子活化以及線粒體分裂有關。最新研究還顯示，細胞凋亡與心臟瓣膜疾病的預后存在密切聯系，Jan等[28]通過收集接受瓣膜置換手術患者的瓣膜組織并將術后切除的瓣膜分成兩部分，一部分包含受損結節，另一部分由周圍組織組成作為對照，結果提示ARC的表達在所有主動脈瓣以及二尖瓣功能障礙(反流與狹窄)的病理狀態下均顯著減少，并證實ARC可能受到其上游因子如miR-214的調節，但其具體作用及機制仍待深入研究。

總結與展望

綜上，ARC是介導CVD發生發展及轉歸過程中重要的調控因子，并可通過其抗凋亡效應發揮心肌保護作用。最近研究顯示，通過調控ARC介導的凋亡途徑可以減輕由阿霉素誘導的心臟毒性，這對于克服化療治療癌癥產生的心臟毒性提供新的治療手段和理論依據[29]。因此，進一步深入研究ARC在CVD中的作用刻不容緩，是否存在其他上游靶點如miRNA可以調控ARC的表達[30]，其不同的上游靶點之間是否存在相互協同或拮抗作用？ARC抑制線粒體膜電位去極化是否會影響其能量代謝作用？隨著ARC及其上游調控靶點在各種CVD中調控機制的不斷明確，ARC的抗凋亡作用將成為心臟疾病治療的有效靶點，為臨床上疾病的預防及治療奠定理論基礎。