大豆油脂的合成途徑及關鍵酶GPAT基因的研究進展

魯中爽，劉思言，李廣隆，王 蕊，劉明明，么夢凡，關淑艷，姚 丹

（吉林農業大學生命科學學院，吉林 長春 130118）

大豆〔Glycine max（Linn.）Merr.〕隸屬于豆科大豆屬，為一年生草本植物［1］，在全球范圍內都有廣泛種植。大豆含有豐富的脂肪酸、蛋白質及多種營養物質［2-3］，其中大豆油脂目前仍占據世界總食用植物油脂的首位。我國不僅是大豆原產國，也是世界上最大的大豆進口國，由于國產大豆的產量和產油率不高，隨著石油資源的日益缺乏、人類對高質量油脂需求的增長、對可再生資源的依賴性和環保意識的增強，培育各種比例更健康的油料和提高大豆油脂含量有很大的市場需求。面對國內對豆油的需求量日漸提高，以及在未來較長一段時間內我國仍需繼續進口大量大豆及豆油的局面將很難發生實質性改變，因此提高我國大豆種子中的油脂含量，獲得高油轉基因大豆用于大豆油的生產具有重要意義，科研工作者有義務研究如何更好地提高大豆植物油脂含量及品質［4-5］。

隨著生命科學的迅速發展，大量植物功能基因被分離并克隆出來，合成植物油脂的代謝途徑中某些調控基因的分子機制和表達調控方式的闡明，對利用基因工程手段從分子水平上有針對性地改良大豆油料作物，生產有用的脂肪酸、提高植物油脂的質量及增加機體的抗逆性等發揮重要作用，這種新發展的分子育種沖破了傳統育種的阻礙，是一種很有研究價值的育種手段［6-7］。三酰甘油是大豆油脂的主要成分，而脂肪酸是三酰甘油的來源產物，因此調節終產物三酰甘油和脂肪酸的合成表達，是提高大豆油脂的主要途徑之一。在三酰甘油的合成過程中，甘油三磷酸?；D移酶（GPAT）是合成途徑中第一步反應關鍵酶，生物合成的限速酶，最終將脂肪酸催化形成三酰甘油，改變GPAT活性影響大豆油脂的組成和積累。因此通過分子育種技術手段過表達GPAT基因來改良大豆油脂并對油料作物育種有重要意義。

1 大豆油脂

1.1 大豆油脂的組成

大豆油脂的化學成分為三酰甘油（triacylglycerol，TAG），由甘油和3分子長鏈脂肪酸在多種酶的催化下形成，因此脂肪酸是植物油脂的重要組成成分，植物油脂的質量及在各方面的用途受脂肪酸的組成影響。

大豆油脂主要在質體和內質網中合成，脂肪酸前體在質體中通過聚合反應生成飽和脂肪酸，在硬脂酰-ACP脫飽和酶（SAD）的催化下生成18∶1-ACP，作為游離脂肪酸的底物，在?；o酶A合成酶的作用下，合成?；o酶A并進入內質網中。后通過一系列酶的作用合成油脂前體 -TAG［8］。

1.2 大豆油脂的代謝合成途徑

油脂的合成代謝是維系其生命活動的基本代謝之一，也為人類提供了重要的能量來源，主要分為：脂肪酸的從頭合成、脂肪酸的脫飽和、三酰甘油的合成及油體形成，合成途徑如圖 1 所示［9］。

圖1 大豆油脂代謝合成途徑

1.2.1 脂肪酸的從頭合成 蔗糖是油脂合成的代謝的主要碳源，蔗糖通過糖酵解、磷酸戊糖途徑和卡爾文循環生成磷酸二羥丙酮和乙酰輔酶A作為三酰甘油的合成原料［10］。乙酰輔酶A在乙?；o酶A羧化酶作用下生成丙二酰輔酶A，再與?；d體蛋白結合，在丙二酰輔酶A?；d體蛋白轉移酶生成丙二酰-ACP（MCAT）的催化下生成丙二酰ACP。隨后，一分子乙酰輔酶A與多分子丙二酰輔酶A在脂肪酸合酶復合體的作用下，經縮合、羰基還原、脫水，再還原多次循環，每多一個循環β-酮脂?；鵄CP比上一循環多兩個碳原子的?；鵄CP逐步生成含12～18個碳脂肪酸［11］。

1.2.2 脂肪酸的脫飽和 SAD催化18:0-ACP形成18∶1-ACP單不飽和脂肪酸；另外通過?；?ACP硫酰酶（FAT）催化部分18:1-ACP單不飽和脂肪酸生成自由脂肪酸。自由脂肪酸在長鏈?；o酶A合成酶的作用下生成?；o酶A為三酰甘油的合成提供底物并運到內質網上。另外在一系列酶的作用下將剩下的18∶1-ACP單不飽和脂肪酸生成磷脂酰膽堿（PC），PC是FAD的唯一底物來源。在FAD 的作用下生成亞油酸、亞麻酸［12］。

1.2.3 三酰甘油的合成 Kennedy途徑即脂酰輔酶A和甘油三磷酸在內質網中先由GPAT催化形成1-單酰甘油三磷酸；隨后在溶血磷酸?；D移酶（LPAAT）催化下形成PA；磷脂酸磷酸化酶使PA去磷酸基，形成DAG；最后在DGAT的作用下與另一分子脂酰輔酶A形成TAG。另外磷脂酰膽堿（PC）sn-2位上的?；诹字８视王；D移酶（PDAT）作用下轉移到DAG上，形成TAG和LPAA。還有逆脂酰轉移酶（TA）將二酰甘油上的一個脂?；D移到另一個二酰甘油上，形成三酰甘油和一酰甘油［13-14］。三酰甘油所含有的3個脂肪酸可以是飽和脂肪酸也可以是不飽和脂肪酸，可以是相同的脂肪酸也可以是不相同的脂肪酸［12］。

1.2.4 油體形成 油體蛋白與三酰甘油形成油體。三酰甘油在油體中成液態，油體蛋白在外面包裹的半單位膜中，由半單位膜包裹液態基質三酰甘油脂形成油體。而高含量的三酰甘油可以在內質網膜脂質雙層膜結構中形成“脂質凸起”進而從膜結構中分離出來，形成油體。烘干種子過程中植物油體蛋白能夠保持油體穩態，并在油體之間相互作用和改變油體膜結構中起到重要作用［15］。

1.3 大豆油脂的功能

大豆油脂是國際市場上重要商品之一，是醫藥、化工、生物柴油等原料［16-18］，也是居民餐飲中重要的食物能源，同時還可作為一種可再生的生物能源。隨著國內油料消費增加，油料加工產品需求的快速增長，帶動了國內油脂油料種植業的發展，因此研究如何提高大豆油脂的產量至關重要。

脂肪酸作為細胞組成的重要成分又是重要能源物質，還是某些信號分子的前體，與人類的生活緊密聯系，很多研究者一直很重視對脂肪酸的研究［19］。大豆油脂的結構成分主要是不飽和脂肪酸，對維持植物膜系統液晶狀態和延長植物細胞有重要作用，同時構成葉綠體膜骨架的主要成分也是不飽和脂肪酸，起著對類囊體穩定的作用［20］。大豆不飽和脂肪酸對人體具有降低人體中膽固醇含量、減少腦血栓的形成的作用，對動脈硬化和心腦血管疾病的預防和治療起到保健作用，而過多攝取飽和脂肪酸可增加患有心血管疾病的風險。提高不飽和脂肪酸中的亞油酸、亞麻酸可增加生物燃料釋放的能量、降低廢渣溫度而提高利用率，高油酸的生物燃料的氧化穩定性更高，油脂中亞麻酸含量高會導致大豆油保質期減短，大豆油易酸敗，而人體中不能合成身體所需的亞油酸和亞麻酸的必須脂肪酸，必須從植物中攝取得到，因此根據人體和工業需求不同，培育不同配比脂肪酸的大豆品種具有可行性，提高大豆油脂具有一定的應用價值［21］。

2 甘油三磷酸轉移酶（GPAT）

2.1 GPAT基因分類

GPAT基因在擬南芥、菠菜、向日葵、豌豆、水稻等多種植物中被克隆出來，在擬南芥中發現GPAT基因家族有ATS1、AtGPAT1/2/3/4/5/6/7/8/9 等10個成員，其中ATS1定位于質體，AtGPAT1/2/3定位于線粒體，AtGPAT4/5/6/7/8/9定位于內質網［22-23］。AtGPAT1/4/5/6/7/8具有sn-2?；D移活性，AtGPAT4/6/8還具有磷酸酶活性［24］。很多研究表明AtGPAT1與養分的分泌和絨氈層分化有關［25］；AtGPAT4與植物莖、葉中角質的合成有關，AtGPAT5與木栓質脂肪族化合物的積累有關，影響木質栓的合成，AtGPAT6/8與花瓣中角質的合成有關，AtGPAT9與家族中其他幾個成員的一致性在10%左右，與動物中GPAT4結構域有很高的同源性，參與脂肪細胞中脂肪酸的合成，并且不同植物的GPAT9氨基酸的保守性很高，在種胚發育期表達量顯著提高，導致AtGPAT9對大豆油脂的積累起到重要的調控作用。但GPAT家族中哪個基因在種子發育中大量表達仍需研究［26］。

2.2 GPAT基因分子特征

GPAT的C端序列較為保守，在靠近C端的區域所有GPAT基因都含有脂?；呋Y構域，該結構域中有4個（模體I、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）高度保守的模體。這些模體對GPAT的脂?；D移酶活性及其結合G3P底物至關重要。不同的GPAT的N端序列差別較大，因此不同的GPAT之間的分子大小、生化特性及亞細胞定位也有所不同。同時不同的GPAT具有（脂?；滈L度、不飽和度及ω-氧化程度的選擇性）不同的脂?；N類, 從而參與不同的脂質代謝過程［27］。

在內質網上，GPAT是三酰甘油合成途徑中第一關鍵酶，主要負責將飽和脂肪酸?；D移到甘油三磷酸（G-3-P）的sn-1號位上，形成溶血磷脂酸（LPA）。隨著研究發現，GPAT還可將?；D移轉移到G-3-P的sn-2號位上，可產生sn-2LPA或sn-2-單酰甘油（sn-2MAG），但具有?；D移sn-2位特異性的GPAT只在陸生植株中被發現，因此生化分子生物學國際聯合酶學委員會命名這一具有?；D移到sn-2位上的特異性GPAT酶為EC2.3.1.198［24］。

大多數GPAT酶（GPAT1、GPAT2、GPAT3、GPAT4 和GPAT5）已被報道居住在內質網中，通過保守的跨膜基序錨定在那里。GPAT1受位于30 kb間的近端和遠端啟動子的調控，在內質網合成三酰甘油（TAG）的第一步限速步驟是由GPAT3 或GPAT4催化的，它將G-3-P和脂肪酰輔酶A（FA-CoA）轉化至LPA。然后通過GPAT酶將LPA轉化為磷脂酸（PA），PA隨后通過脂蛋白PAP酶（lipin 1,2或3）去磷酸化為二酰甘油（DAG），TAG生物合成的最后一步是將DAG轉化為由DGAT1和DGAT2催化的TAG，DGAT1和DGAT2的內質網膜定位可能是不同的［28-29］。G-3-P途徑的酶除了調節TAG合成外，也影響磷脂合成，如：由GPATs產生的PA可作為合成酸性磷脂、磷脂酰乙醇或磷脂酰肌醇、心磷脂的底物；由脂蛋白PAP酶作用產生的DAG可以轉化為TAG或磷脂、磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰絲氨酸［30］。

2.3 GPAT功能

GPAT催化?；w向?；D移［31］，磷脂酰甘油（PG）在?；窯PAT的催化下，GPAT具有ACP的結合位點，它能催化?；o酶A或?；鵄CP到脂肪?；孽ソ粨Q［32］，以為?；w的GPAT酶定位于質體，屬胞質溶解型GPAT；以acyl-CoA為?；w的GPAT酶定位于內質網和線粒體屬膜結合型GPAT。將acyl-ACP的?；D移到甘油三磷酸的sn-1位上合成溶血磷脂酸（LPA）［33］，該反應構成儲存-脂質組裝的第一步，并且在極性和細胞外脂質生物合成中也是重要的［34］。將acyl-CoA的?；D移到LPA的sn-2位上，溶血磷脂酸?；D移酶（LPAT）催化形成磷脂酸（PA），后續反應之后形成 TAG［23］。

由于GPAT酶?；D移位點特異性和底物選擇性為脂質合成提供了底物，GPAT在植物生長發育過程中發揮重要作用，不同GPAT基因發揮著不同的表達模式，表現出多種生理功能：（1）與植物的育性有關：在擬南芥花粉發育過程中，AtGPAT1/6共同影響擬南芥的結實率，AtGPAT1/6突變體會阻礙雄蕊長纖絲的伸長和導致小孢子的釋放，減少授粉概率導致結實率降低［35］；（2）與植物的耐高溫、抗低溫有關：在酶學的研究中發現兩類GPAT，一是可以優先選擇188∶1脂肪酸為底物的選擇型GPAT，二是以16:0脂肪酸為靶向底物優先選擇18∶1脂肪酸的非選擇型GPAT，一些研究表明選擇型酶是耐冷植物，非選擇型酶是冷敏感植物，在較低溫度下，順式不飽和磷脂酰甘油（PG）比飽和磷脂酰甘油能更好地防止膜相變，在低溫下的流動性及生物膜的飽和度影響耐冷性［36］；（3）與植物的耐干旱和耐高濃度鹽有關：AtGPAT突變體導致擬南芥幼根和種皮中軟木脂含量降低，由于軟木脂阻止病原體入侵植物的物質，并能控制溶質和水分的運輸，因此在高鹽下容易失水，使得滲透性急劇增加和導致存活率降低［37］；（4）與種子含油量有關：GPAT基因是脂肪酸合成途徑中第一關鍵酶，擬南芥種子總脂肪酸的含量高達30.5%～40%，目前在擬南芥中已鑒定出9種GPAT基因，可見GPAT與油分組成相關，可提高種子重量和含油量［38］；（5）其他功能：具有磷酸酶活性，可能因GPAT基因編碼的酶其-N-端存在HAD-like 結構域有關，GPAT可對受傷植物進行修復傷口的功能，GPAT基因催化?；o酶A或?；鵄CP到脂肪?；孽ソ粨Q具有ACP的結合位點［37］。

3 GPAT基因在大豆油脂合成途徑中的應用

最近幾年GPAT基因作為調節脂肪酸的關鍵基因，其表達涉及油脂的合成在某些植物中的應用相繼開展。2013年，郝靜芳［39］認為GPAT7 和GPAT9參與擬南芥種子中TAG的合成及一些不飽和脂肪酸和調節。2014年，劉聰［37］在研究甘油型油菜的GPAT6基因的克隆與分析中發現GPAT6基因改變了擬南芥種子脂肪酸成分的比例；Sui等［40］在擬南芥中的通過過表達SsGPAT來提高磷脂酰甘油的不飽和脂肪酸含量，可以增強擬南芥耐鹽性并緩解鹽脅迫下PSII和PSI的光抑制。2016年，Niu等［41］在三角褐指藻中克隆了GPAT基因并在三角褐指藻中過表達，通過GC-MS分析脂肪酸組成，顯示與野生型相比有更高的不飽和脂肪酸比例，鑒定出的GPAT可以上調三角褐指藻中TAG的生物合成。2017年，Srinivasan等［42］發現AGPAT1過表達顯著改變了初級代謝，總脂質含量增加，但總碳水化合物和可溶性蛋白質含量降低，結果表明AGPAT1過表達可以提高TAG的生物合成；皮廣靜［43］在研究花生油脂合成?；D移酶基因表達與籽仁含油量相關性分析時發現，GPAT3個時期平均表達量與含油量顯著正相關；Aparna等［44］克隆了麻風樹的兩種GPAT基因并導入擬南芥中過表達，發現總油脂含量增加等。以上研究都證明了GPAT基因參與到調解脂肪酸的過程，對油脂的合成起到關鍵性作用。上述事例雖然都證明GPAT基因改變了油脂的含量，卻是不同GPAT成員對不同物種的油脂合成起到調控作用，其他物種中的GPAT基因的功能是否對油脂的合成起到調節作用還有待研究。

由于GPATs在不同時期和不同組織的表達模式存在顯著差異，預示著其參與不同的脂質代謝和生物學過程中GPAT的不同。通過這些實例可以表明GPAT基因的表達影響脂肪酸的合成，對油脂含量起到調控作用。GPAT基因作為油脂合成途徑中關鍵的?；D移酶，大豆中也含有GPAT基因，但至今還未驗證大豆GPAT基因是否對油脂的合成起到調控作用，同時大豆GPAT基因的活性和某些生物學功能還有待進一步研究。因此研究GPAT基因表達及促進大豆油脂合成的功能性分析可能對獲得高油轉基因大豆用于大豆油的生產具有重要意義。

4 展望

大豆油脂合成涉及大量的基因及其編碼的酶類，是一個極其復雜的過程，改變任何一個因素都可能造成植物含油量或者油酸成分的改變，因此弄清大豆油脂合成的每一個環節都具有重要意義。雖然GPAT基因作為油脂合成的關鍵酶，但目前對植物GPAT基因家族的認知卻主要集中于擬南芥中。植物GPAT基因家族雖然只是一個小家族，卻具有多種功能，GPAT基因的多樣性和重要性很容易激起科研工作者對其深入研究的熱情。GPAT?；D移酶位點特異性和對底物的選擇性為什么會對植物的生長發育起到調控作用、單個還是多個GPAT 成員對油脂代謝合成途徑起作用以及大豆中GPAT基因的生物學功能等問題還有待探索。

隨著人們對生活質量要求的提高，現在對油料作物的開發與利用越來越重視，油料植物不僅可供人體需求還可作為環保清潔能源，在生活中很多方面都有應用，科研工作者也越來越重視油料作物研究趨向人類需求的方向。大豆作為世界較大的產油作物，GPAT基因也是高等植物中油脂合成途徑中的關鍵酶，雖然GPAT基因在很多植物中都克隆出來并進行了功能驗證，但在大豆中的相關報道很少，利用基因工程等新科技手段，對大豆合成三酰甘油途徑中第一關鍵酶GPAT基因的克隆及驗證功能還需科研工作者進一步研究。